DNA-ekstraktion ved spolefremgangsmåde

Deoxyribonukleinsyre og proteiner. DNA er organiseret i enheder kaldet gener, der hver koder for en bestemt RNA- eller proteinsekvens. Gener studeres for at lære om biologisk struktur og funktion, evolution, sygdom og mange andre aspekter af levende systemer. For at studere gener i detaljer skal DNA isoleres og renses fra celler af interesse.

DNA-ekstraktion

Selv om DNA fra en enkelt celle kan ekstraheres og studeres, er det ikke nok at se med blotte øje. For at få en mængde tilstrækkelig til spooling, jo flere celler skal du arbejde med det bedre (mange millioner).

Præcise protokoller varierer betydeligt for at tage højde for de unikke egenskaber ved specifikke prøver, men de generelle trin er homogenisering, lysis, fordøjelse, adskillelse og indsamling. Fremgangsmåden udføres bedst i en lille (afhængig af stikprøven) glas eller plastrør.

En prøve blandes i almindelighed eller grundes for at adskille cellerne grundigt fra hinanden. Dette gør celledele ingredienser mere tilgængelige for de reagenser, der følger. Vaskemiddel eller enzymer tilsættes derefter til homogenatet for at lysere cellemembranerne (og nukleare membraner, hvis cellerne er eukaryote) for at frigøre DNA'et. På dette tidspunkt er DNA'et omgivet af proteiner, lipider, kulhydrater --- alt andet, der var indeholdt i cellerne.

En yderligere enzymatisk fordøjelse kan være nødvendig for at nedbryde proteiner, så de ikke binder til DNA og forstyrre samlingen. DNA separeres fra resten af ​​celleindholdet ved tilsætning af kold, ren, ethyl eller isopropylalkohol. DNA er ikke opløseligt i disse alkoholer, så det vil kondensere for at forsøge at minimere sin kontakt med alkoholen. Det kondenserede DNA s opsamles derefter, sædvanligvis ved centrifugering --- eller spoling.

DNA spoling

DNA-samling ved spoling er effektiv, når en stor mængde DNA opnås fra en ekstraktionsprocedure. Det er også en fremragende demonstrationsmetode, da en imponerende fløjte af rent DNA er tydeligt synligt.

For at spole DNA skal separationstrinnet udføres omhyggeligt. Hvis det ikke var en del af den tidligere tilsatte lysisreagensblanding, skal der tilsættes en koncentreret saltopløsning (natriumchlorid) til opløsningen før alkoholadditionsstrinnet. Den kolde alkohol hældes langsomt ned langs prøvestøens side for at danne et lag oven på den vandige opløsning, idet man undgår blanding. Hvis det gøres korrekt, danner alkoholen sit eget lag oven på det saltlag. Så kommer spolingen.

For at samle DNA'et fra det saltlag, skal du forsigtigt placere en glasrørstang om alkohollaget, indtil det rører bunden af ​​røret. Drej langsomt stangen mellem fingrene, mens du ser grænsefladen mellem de to lag. Hvis der er tilstrækkeligt DNA til stede, vil det klumpe sammen ved grænsefladen mellem lag for at danne en mælkeagtig gennemsigtig masse. Spin stangen for at pakke DNA'et rundt om det (det er spoledelen) og træk det ud af røret. DNA'et kan overføres til et andet rør af ren alkohol til opbevaring eller yderligere analyse.