Videnskab
 science >> Videnskab >  >> Biologi

GTE's rolle i DNA-ekstraktion

I molekylærbiologi kan godt buffervalg og forberedelse til forskellige DNA-isoleringstrin være forskellen mellem at gå videre til proteinekspression eller åbne et andet maxi-prep-kit til at starte forfra. På trods af deres afgørende betydning er bufferopskrifter ofte bare det - opskrifter skrevet uden forklaring eller begrundelse for de forskellige komponenter. En sådan buffer er glucose-tris-EDTA eller GTE-buffer.
Hvad bruges GTE til?

GTE bruges til at resuspendere bakteriecellepellets før lysering (åbning) af cellerne og høstning af plasmid-DNA inde. Lysozym, der blødgør cellemembranerne, tilsættes ofte sammen med GTE-pufferen. At opnå en homogen suspension af hele celler under dette trin, så den efterfølgende tilsatte lysopløsning kan komme til alle cellerne, er nøglen til at få gode DNA-udbytter. GTE er designet til at gøre dette, samtidig med at det giver et stabilt miljø for DNA.
Glukose til osmolaritet |

50 mM (millimolær) glukosesukker tilsættes til GTE-puffer for at opretholde osmolaritet, hvor opløst koncentration uden for cellerne er tæt på det inde i cellerne. Dette forhindrer for tidlig cellelysering, som kan forårsage lavere DNA-udbytter på grund af aggregering og nedbrydning. De øvrige komponenter i pufferen bidrager også til opløsningens osmolaritet, men glukose, der er en ikke-elektrolyt, er et godt valg, fordi det ikke forstyrrer opløsningens pufferegenskaber.
Tris for pH-stabilitet

Tris er det korte navn på tris (hydroxymethyl) aminomethan, som er en meget almindelig pH-buffer. I tilfælde af GTE-puffer sættes syresaltet (Tris-HCI) til pufferen i en koncentration på 25 mM. Dette opretholder opløsningens pH ved en næsten fysiologisk 8,0, en ideel pH til at forhindre sur hydrolyse (nedbrydning) af plasmid-DNA og uønskede bivirkninger af de andre cellekomponenter. EDTA Forebygger DNA-nedbrydning

EDTA eller ethylendiaminetetraeddikesyre fanger eller "chelaterer" metalioner ud af opløsningen, hvilket forhindrer dem i at deltage i uønskede bivirkninger. I GTE-buffer tilsættes EDTA ved 10 mM. Dets primære formål er i pufferen til at afrunde fri zink, magnesium og calcium, og derved forhindre DNA-nedbrydning ved visse veje, der kræver disse metaller.
Nogle vigtige tip

Hold din GTE-puffer kold og gør den i små mængder for at forhindre vækst af utilsigtede bakterier i det. Sukker og den kontrollerede pH giver et godt vækstmedium. Brug altid renset vand. Ledningsvand kan have et overskud af metalioner fra rørene, hvilket kan overvælde EDTA's evne til at fange. Hvis du har mistanke om tilstedeværelsen af interfererende RNA i din prøve, skal du tilføje RNase A med 100 mikrogram pr. Ml til din GTE-buffer for at eliminere problemet.