Videnskab
 science >> Videnskab >  >> Biologi

Fordele og ulemper ved Western Blot

Western blot, en analytisk teknik, der anvendes til at bestemme et specifikt protein i en given prøve, anvender et enzym eller fluorescensmærkede primære antistofs evne til at binde til dets specifikke antigen. Det er en tre-trins proces, der begynder med gelelektroforese, efterfulgt af membranblotting og sondering med antistoffer. Proteindetektion kan være direkte eller indirekte, hvor sidstnævnte anvender et mærket sekundært antistof rettet mod det primære. Selvom accepteret som en rutinemæssig proteinanalyse teknik, har western blot begrænsninger og fordele.

Fordel: Sensitivitet

En af de største argumenter til fordel for western blot er dens følsomhed. På grund af dets evne til at detektere så lidt som 0,1 nanogram protein i en prøve, kan teknikken teoretisk tjene som et effektivt tidligt diagnostisk værktøj, idet der endog registreres det mindste immunogene respons fra en virus eller bakterier i en patientprøve. En indirekte western blot bygger videre på denne følsomhed ud fra det sekundære antistofs evne til at amplificere intensiteten af ​​signalet detekteret af billeddannelsessystemet. Større følsomhed betyder, at færre antistoffer er nødvendige til testning, hvilket reducerer laboratoriekostnaderne betydeligt.

Fordel: Specificitet

Western blot-teknikken skylder sin specificitet for to store bidragende faktorer. Først sorterer gelelektroforese en prøve i proteiner af forskellig størrelse, ladning og konformation. Denne proces er i sig selv et stort skridt mod detektion, da bånd dannet i gelen allerede giver spor om størrelsen af ​​proteinet eller polypeptidet af interesse. Specificiteten af ​​antistof-antigen-interaktionen tjener som den anden store faktor. Fordi specifikke antistoffer viser affinitet for specifikke proteiner, kan processen selektivt detektere et målprotein selv i en blanding af 300.000 forskellige proteiner.

Ulempe: udsat for falske eller subjektive resultater

På trods af dets følsomhed og specificitet, kan et western blot stadig frembringe fejlagtige resultater. En falsk positiv resultat, når et antistof reagerer med et ikke-tilsigtet protein, hvilket er det, der ofte sker, når en patient, der testes for hiv, har tuberkulose eller en række parasitære infektioner. En falsk-negativ kan derimod nemt resultere, hvis større proteiner ikke får tilstrækkelig tid til at overføre korrekt til membranen. Ukorrekt blotting og forarbejdning producerer ofte skævt, falmet eller endda flere bånd, hvilket gør testresultater underlagt teknikkens fortolkning.

Ulempe: Høj pris og teknisk efterspørgsel

Omkostningerne ved en vestlig blot er en sammensætning af de store individuelle udgifter til mærket antistoffer, dygtige analytikere og laboratorieudstyr. En delikat proces, western blotting kræver præcision i hvert trin for korrekt identifikation af en stikprøves bestanddele. En mindre fejl i reagenskoncentration eller i inkubationsperiode kan være katastrofalt for hele processen. Endelig kan det udstyr, der kræves til detektion og billeddannelse - kemiluminescerende, fluorescerende, radioaktive eller laser detekteringssystemer - være for dyrt for den gennemsnitlige mikrobiologiske enhed.

Klik for at udvide hele teksten