Hvad er den mest logiske rækkefølge af skridt til splejsning af udenlandsk DNA?

Det var ikke så længe siden, at genteknologi var science fictionens ting - at gøre en organisme vokse med egenskaber hos en anden. Men siden 1970'erne har genetiske manipulationsteknikker avanceret til det punkt, hvor splejsning af fremmed DNA i en organisme er næsten rutinemæssig. For eksempel kan gener for skadedyrsbestandighed splejses i majs, gener til fremstilling af humant insulin kan sættes i bakterier, og gener til efterligning af humane kræftformer kan sættes i laboratoriemus. Detaljerne i proceduren er for komplekse til at beskrive i en kort artikel med mange muligheder i hvert trin, men den konceptuelle disposition af den logiske sekvens af trin er ret ligetil.

Inkuber plasmid DNA og DNA af interesse med et restriktionsenzym. Restriktionsenzymet vil detektere en specifik sekvens af DNA baser og skære DNA'et adskilt fra det tidspunkt. Restriktionsenzymer er afledt af nogle bakteriers forsvarsmekanisme mod virus. De er molekyler, der vil snappe DNA, hvor de opdager et givet mønster af baser.

Inkuber det adskilt plasmid og de genomiske DNA-fragmenter med DNA-ligase. Med de fleste restriktionsenzymer vil det cirkulære plasmid og de genomiske DNA-fragmenter have komplementære "klæbrige ender", som vil tage fat på hinanden. DNA ligase vil derefter afslutte limning af stykkerne sammen. Resultatet er en flok cirkulære plasmider, der indeholder dele af det genomiske DNA.

Indsæt plasmiderne i bakterier og dyrk bakterierne for at dyrke kolonier af organismer imprægneret med modificeret DNA. Hvis dit plasmid har et antibiotikaresistent gen, som værtsbakterierne mangler, kan du automatisk screene for vellykkede modificerede bakterier ved at dyrke bakterierne på antibiotikuminfunderet vækstmedium. Der er flere metoder til indsættelse af plasmiderne i bakterierne, såsom anvendelse af en mikronedle, anvendelse af et elektrisk felt for at åbne små huller i bakteriens membran eller blot at sætte bakterierne og plasmiderne sammen i samme opløsning og lade bakterierne absorbere dem naturligt.

Prøveceller fra de forskellige kolonier af modificerede bakterier. Vask de samplede celler med en vaskemiddelopløsning for at nedbryde bakteriemembranerne og ekstraher DNA'et, opvarm det eller udsæt det for natriumhydroxid for at adskille strengene. Dette udsætter DNA-basens basesekvens til analyse.

Inkubér DNA'et med en fluorescerende probe. Skin et ultraviolet lys på det inkuberede DNA og observere for fluorescens. Sonden består af en kort sekvens af DNA, der matcher det genomiske DNA, du har indsat. Hvor sonden stemmer overens med det DNA, du leder efter, vil det gløde, når det lyser.

Isolér bakterierne fra kolonierne, der indeholder det gen, du søger at indsætte. Dupliker dit DNA ved enten at lade bakteriekolonierne vokse eller ekstraher DNA'et som du gjorde før og duplikere det i en polymerasekædereaktionsmaskin.