Hvad er første trin i en polymerase kædereaktion?

Polymerasekædereaktion eller PCR er en teknik, som fotokopierer et fragment af DNA i mange fragmenter - eksponentielt mange. Det første skridt er i PCR er at opvarme DNA'et, så det denaturerer eller smelter ind i enkelte tråde. Strukturen af ​​DNA er som en rebstige, hvor sporene er reb med magnetiske ender. Magneterne forbinder for at danne rungene, kaldet basepar, og dermed modstå at blive trukket fra hinanden. Hvert fragment af DNA smelter i enkelte tråde ved forskellige temperaturer. Forståelse af, hvordan DNA-strukturen holdes sammen af ​​DNA's individuelle dele, vil give indsigt i, hvorfor forskellige DNA-fragmenter smelter ved forskellige temperaturer, og hvorfor sådanne høje temperaturer er nødvendige i første omgang.

Smeltning! Smeltning!

Det første trin i PCR er at smelte DNA'et, så dobbeltstrenget DNA adskilles i enkeltstrenget DNA. For pattedyrs-DNA involverer dette første trin sædvanligvis varme på ca. 95 grader Celcius (ca. 200 Fahrenheit). Ved denne temperatur bryder hydrogenbindingerne mellem A-T og G-C-baseparene eller sporene i DNA-stigen fra hinanden og unzipper det dobbeltstrengede DNA. Men temperaturen er ikke varm nok til at bryde fosfat-sukker-rygraden, der danner de enkelte tråde eller stigenes poler. Komplet adskillelse af enkelte tråde forbereder dem til det andet trin af PCR, som køler for at tillade korte DNA-fragmenter, der kaldes primere, at binde enkeltstrengene.

Magnetic Zippers

En grund DNA er opvarmet til den høje temperatur på 95 grader Celcius er, at jo længere DNA-dobbeltstrengen er, desto mere vil den forblive sammen. DNA længde er en faktor, der påvirker smeltepunktet valgt for PCR på det stykke DNA. A-T og G-C-basen parrer i den dobbeltstrengede DNA-binding med hinanden for at holde dobbeltstrengstrukturen sammen. De mere sammenhængende basepar mellem to enkeltstrenger har bundet, jo mere deres naboer også vil binde, og jo stærkere tiltrækkes de to tråde. Det er som en lynlås lavet af små magneter. Når du lukker gliplåsen, vil magneterne naturligvis glide op og blive lynlås.

Stærkere magneter Stick mere tæt

En anden faktor, der påvirker hvilken smeltetemperatur at vælge for dit DNA-fragment af interesse er mængden af ​​GC basepar til stede i dette fragment. Hvert basepar er som to mini-magneter, der tiltrækker. Et par lavet af G og C er meget stærkere tiltrukket end et A og T par. Således vil et stykke DNA, som har flere G-C par end et andet fragment, kræve en højere temperatur før smeltning i enkelte tråde. DNA absorberer naturligt ultraviolet lys - ved 260 nanometerbølgelængden, at være præcis - og enkeltstrenget DNA absorberer mere lys end dobbeltstrenget DNA. Så måling af mængden af ​​lys absorberet er en måde at måle, hvor meget dit dobbeltstrengede DNA har smeltet ind i enkelte tråde. Den "magnetiske lynlås" -virkning af G-C og A-T-basepar er, hvad der forårsager en graf af lysabsorbansen af ​​dobbeltstrenget DNA, der er tegnet mod en stigning i temperaturen for at være sigmoidal, formet som en S og ikke en lige linje. Sekvensens kurve repræsenterer den samarbejdsresistens, som baseparerne udøver mod varmen, fordi de ikke ønsker at adskille.

Halvvejspunktet

Den temperatur, hvor en DNA-længde smelter i enkeltstrengene kaldes dets smeltetemperatur, som betegnes med forkortelsen "Tm." Dette angiver den temperatur, hvor halvdelen af ​​DNA'et i en opløsning er smeltet ind i enkelte tråde, og den anden halvdel stadig er i dobbeltstrenget form. Smeltetemperaturen er forskellig for hvert fragment af DNA. Mammalian DNA har et G-C-indhold på 40%, hvilket betyder, at de resterende 60% af baseparrene er As og Ts. Dets 40% G-C-indhold bevirker, at pattedyrs-DNA smelter ved 87 grader Celsius (ca. 189 Fahrenheit). Derfor er det første trin i PCR på pattedyrs-DNA at opvarme det til 94 grader Celcius (201 Fahrenheit). Bare syv grader varmere end smeltetemperaturen og alle dobbelte tråde vil helt smelte til enkelte tråde.