Ny dyse sparer krystaller - koncept med dobbelt flow udvider spektret til proteinkrystallografi

Forskere er interesserede i proteiners rumlige struktur for at lære om disse biomolekylers funktion. Denne viden kan føre til en bedre forståelse af biomolekylers funktioner og til skræddersyede lægemidler. Røntgenkrystallografi er det primære værktøj til at løse proteinstrukturer. Imidlertid, det kræver voksende krystaller af de proteiner, der undersøges. Når røntgenstråler rammer disse krystaller, de skilles fra atomerne for at danne et karakteristisk mønster, hvorfra krystalets rumlige struktur - og dermed proteinmolekylerne - kan beregnes.

Imidlertid, mange proteiner kan ikke lide at blive presset ind i krystaller, da det modsiger deres naturlige tilstand. "Dyrkning af proteinkrystaller er kompleks. Mængden af ​​protein, der kan produceres, er ofte begrænset til få milliontedele gram, og ofte, kun meget små krystaller kan opnås, "siger Dominik Oberthür fra DESY, rapportens hovedforfatter. Med de ekstremt lyse blink fra røntgenfri-elektronlasere, selv de mikrokrystaller kan analyseres, men normalt er tusinder af diffraktionsmønstre nødvendige for at løse proteinstrukturen. Da de sarte mikrokrystaller fordampes fuldstændigt af den intense røntgenblitz efter at have leveret deres diffraktionsmønster, en strøm af friske mikrokrystaller sendes gennem laserstrålen. Dette koncept er kendt som seriel røntgenkrystallografi, og har muliggjort analyse af mange tidligere utilgængelige proteiner.

Stadig, selv disse mikrokrystaller er svære at opnå, og kun en brøkdel bliver faktisk ramt af røntgenblitzen, afhængigt af krystalstrømmens geometri og røntgenlaserens tekniske parametre. "Jo mindre krystaller, jo mindre proteinmateriale du har brug for, jo mere gennemførlig er analysen, "siger Oberthür. Bajts team udtænkte et nyt koncept for en såkaldt dobbeltflow-fokuserende dyse (DFFN), der i høj grad reducerer proteinkrystalforbruget. Normalt, proteinkrystallerne injiceres med en eller anden bærervæskebuffer i røntgenstrålen ved hjælp af en speciel dyse. For at danne en tynd stråle, bærervæsken accelereres af en hurtig gasstrøm, der omgiver væsken. Men for at danne en stabil jet, der kræves en minimumshastighed spilder normalt de fleste krystaller i strålen.

For at overvinde disse vanskeligheder, holdet tilføjede ethanol som en sekundær "kappe" -væske mellem gassen og bufferen. Dette fører til at kappevæsken accelereres af gassen. Krystallerne i deres buffer kan derefter injiceres som en meget tynd strøm i midten af ​​ethanolstrålen. "Før, bufferen med krystallerne skulle udføre to opgaver:danne en stabil stråle og bære proteinkrystaller, "forklarede Juraj Knoška, en ph.d. studerende ved CFEL og University of Hamburg, der udviklede dyserne. "Vores tilgang adskiller disse roller og bruger de væsker, der er bedst til jobbet." Ethanol har ideelle egenskaber til at danne en meget stabil jet, som flyder med bare en fin strøm af den krystalbærende buffer i midten. Denne måde, bufferens strømningshastighed kunne reduceres fra ca. 40 mikro liter (milliontedele liter) til kun to mikro liter i minuttet. Også, den bøde, stabil strøm af nanokrystaller kan holdes præcist overlappende med røntgenlaserens lille stråle. Desuden øger reduktionen i den samlede strømningshastighed kvaliteten af ​​diffraktionsmønstrene og den hastighed, hvormed krystaller faktisk bliver ramt af røntgenblinkene.

"Ikke alene reducerer vi krystalforbruget, men vores dobbeltflow-fokuserende dyse gør også brugen af ​​røntgenkilden mere effektiv ved at øge den hastighed, hvormed vi indsamler diffraktionsmønstre af høj kvalitet, "siger Bajt." Desuden, ved hjælp af kappevæsken kan vi undersøge proteiner i buffere, der ikke kunne injiceres før. Vores koncept udvider spektret af biomolekyler, der kan analyseres. "Hendes team testede den nye dyse ved røntgenlaser LCLS i SLAC National Accelerator Laboratory i USA. Forskerne gik sammen med forskellige grupper for at løse strukturer af forskellige proteiner .

"Sammen med gruppen af ​​nobelpristager Roger Kornberg fra Stanford University, vi kunne løse strukturen af ​​enzymet RNA -polymerase II ved stuetemperatur for første gang, "forklarer Oberthür." Da krystallografi ved stuetemperatur er en forudsætning for at studere strukturel dynamik i detaljer, dette åbner døren for fremtidige tidsopløste undersøgelser eller 'molekylære film' med dette vigtige system. "Den nye enhed blev også brugt til at analysere to andre enzymer, en membranbundet hydrogenase og en dioxygenase samt naturligt forekommende proteinnanokrystaller, fra den beskyttende kokon af en specialiseret virus (Cydia pomonella granulovirus, CpGV).

Den dobbelte flow-fokuserende dyse gør også op med et andet praktisk problem ved denne form for jetinjektion:Normalt, ved kanten af ​​konventionelle dyser, buffermateriale, protein- og vand-iskrystaller aggregeres over tid til dannelse af drypstenlignende egenskaber. Det samme sker ofte i bunden af ​​fangsttanken under dysen. Hvis disse protein-is-stalaktitter og stalagmitter vokser ind i røntgenstrålen, de gør ikke kun diffraktionsmønsteret ubrugeligt, deres refleksioner kan være så stærke, at de ødelægger detektoren. Så, nu og da, forsøg skal suspenderes for at fjerne protein-is-drypstenene. "Skedevæsken i vores dyse forhindrer dannelse af sådanne uønskede strukturer. Den dobbelte strømningsfokuserende dyse muliggjorde stabile eksperimentelle forhold i mange timer, "forklarer Oberthür.

"I alle forsøg fungerede dysen ekstremt godt, "opsummerer Bajt." Vi kunne reducere antallet af afbrydelser fra ti til nul i et skift, og vi forventer, at forsøgsstationer på andre røntgenlasere og ved synkrotronlyskilder som DESY's PETRA III også kan drage fordel af fordelene ved vores enhed. "