At se mindre gennemgående celler:En naturlig enkeltcellet biomagnifier til billedbehandling med subbølgelængde

Optiske mikroskoper og pincetter kan afbilde og manipulere objekter i mikroskalaen til applikationer inden for cellulær og molekylær biologi. Den optiske opløsning er, imidlertid, hæmmet af diffraktionsgrænsen, og derfor er både mikroskoper og pincet ikke i stand til direkte at billede og manipulere nano-objekter. Nye teknikker i plasmoniske/fotoniske nanoskoper og nanotweezere har til formål at opnå nanometer-opløsning, selvom materialestrukturer med højt indeks let kan forårsage mekaniske og fototermiske skader på nanoskala biospecimener.

I en nylig undersøgelse nu offentliggjort den Lys:Videnskab og applikationer , Yuchao Li og kolleger ved Institute of Nanophotonics i Kina, udviklet et optisk mikroskop system ved hjælp af levende celler som bittesmå linser til billede og manipulere objekter mindre end lysets bølgelængde. De viste sub-diffraktionsgrænse billeddannelse og manipulation af nano-objekter med en ikke-invasiv enhed, som de konstruerede ved at fange en celle på en fiberspids. Den fangede celle dannede en biomagnifier, der kunne forstørre nanostrukturer med en opløsning på 100 nm, under hvidt lysmikroskopi. Ved hjælp af biomagnifier, Li et al. dannet en nano-optisk fælde til præcist at manipulere en individuel nanopartikel med en radius på 50 nm. Teknikken giver et værktøj med høj præcision til optisk billeddannelse, registrering og samling af bio-nanomaterialer uden mekanisk eller fototermisk skade.

Optisk billeddannelse til manipulation af små objekter er afgørende for medicinsk diagnose, biologisk sansning, cellulær efterforskning, molekylær træning og materialemontering. Pincet og mikroskoper er standardudstyr til billedbehandling uden kontakt og manipulation af minutprøver, der spænder fra få nanometer til flere mikrometer. Alligevel, det er udfordrende at bruge teknologien til at tage billeder i nanoskala, da optisk opløsning er begrænset til cirka halvdelen af ​​belysningsbølgelængden.

Forskere har opnået dramatiske fremskridt inden for nærfeltnanoskoper og nanotweezere i de sidste par årtier for at opnå optisk billeddannelse ved nanometeropløsning. Disse billeddannelsesteknikker blev tilbageholdt af uorganiske materialer med højt indeks, såsom ædelmetaller og halvledere, der blev brugt til deres fremstilling-som mekanisk kan beskadige prøver af biologiske celler eller væv under nærfeltbilleddannelse og manipulation.

Forskere undersøgte derfor enklere optiske billeddannelsesordninger baseret på dielektriske mikrosfærer for at overvinde den diffraktionsgrænse, der er almindelig for konventionelle mikroskoper. Selvom teknikken er etiketfri og mulig, sådanne mikrosfærer er baseret på kunstige uorganiske materialer, såsom siliciumdioxid (SiO ₂ ), titandioxid (TiO ₂ ) og bariumtitanat (BaTiO ₃ ). Forskere er derfor interesserede i at udvikle et naturligt biomateriale til at konstruere en biokompatibel enhed til bioimaging, manipulation og biomagnificering ved nanoskala rumlig opløsning.

Li et al. udvalgte biologiske celler til at erstatte mikrosfærer, da celler både er rigelige og biokompatible i kontakt med biologiske systemer. For eksempel, forskere kan bruge levende celler til at manipulere lys i biologiske miljøer og fungere som optofluidiske mikrolinser, optiske sonder og endda indarbejde E coli som biofotoniske bølgeledere. I det nuværende arbejde, Li et al. forbedrede indekskontrasten for levende celler ved at bruge en sfærisk form halvdypet i et medium for at opnå fokusering på sub-bølgelængden. Forskerne tog biologiske billeder ved hjælp af subdiffraktionslysstedet til at belyse målrettede prøver sammen med hvidt lysmikroskopi. Det nanostore lyspunkt udøvede en stærk optisk gradientkraft for at fange og manipulere en enkelt nanopartikel, der gjorde det muligt for biomagnifier også at fungere som en optisk nanotwezer.

Forskerne udførte alle eksperimenter under et optisk mikroskop med refleksionsmåde koblet til et ladningskoblet enhed (CCD) kamera og objektiv. De brugte lyskilder ved 390 nm, 560 nm og 808 nm til excitation, henholdsvis belysning og fangst. Ved hjælp af en optisk fiber med en konisk spids, Li et al. fanget biomagnifier i enden af ​​fiberen, som de kontrollerede ved at flytte spidsen ved hjælp af en mikromanipulator. Li et al. udvalgte glatte og sfæriske celler for at minimere billedafvigelse og bemærkede, at cellerne udviser bedre fokuseringsevne, når de er halvdypede i opløsning for at opretholde cellelevedygtighed.

Under eksperimentel billeddannelse, forskerne placerede en halvt nedsænket biomagnifier oven på en testprøve og indsamlede de underliggende nærfeltoplysninger fra prøven, at danne et virtuelt billede som detekteret af et optisk mikroskop. Li et al. forberedt en række biomagnificatorer ved hjælp af forskellige celler, herunder bakterier, gær, røde blodlegemer og stamceller. For den første billeddannelsesprøve, de brugte en todimensionel hexagonal silica-nanosfærearray med en 200 nm diameter på et glassubstrat ved hjælp af en fotoforetisk teknik.

Kun nanosfærer med biomagnificatorer oven på dem kunne løses under billeddannelse, der henviser til, at nanosfærer uden bioforstørrere ikke kunne løses ved hjælp af et konventionelt mikroskop. Forstørrelsesfaktoren M for stamcellebaserede bioforstørrere blev bestemt til at være 3,3 gange større (x3,3), og forskerne viste, at den eksperimentelle M var afhængig af biomagnifierens diameter. Efterfølgende, Li et al. udførte alle eksperimenter ved hjælp af bioforstørrere med denne diameter.

For at undersøge anvendelserne af biomagnificatorer, Li et al. afbildede humane epitelceller som billeddannelsesmål ved at dyrke epitelceller på et spejlsubstrat for forbedrede lys-stof-interaktioner via interferens af belysningslyset og refleksionslys. Selvom det var svært at skelne de fibrøse cytoskelet- og dobbeltlagsstrukturer under et konventionelt optisk mikroskop, efter at have placeret en biomagnifier oven på epitelcellerne kunne forskerne løse begge strukturer. For at forbedre billeddannelsesfeltet (FOV), de fangede bioforstørreren på en fiberspids og flyttede den for at scanne prøverne. For eksempel, Li et al. brugte opsætningen til at scanne nanopatronede breve, der stod for et akronym for Jinan University - JNU, som de først skabte på silicium ved hjælp af elektronstråle litografi.

Derefter, når de samtidig bestråler nær infrarøde (IR) og UV -laserstråler på biomagnifikatoren gennem en objektiv, de kunne fange og begejstre nanopartiklerne. Til disse forsøg, forskerne brugte fluorescerende nanopartikler med en gennemsnitlig radius på 50 nm. Da de fangede en enkelt nanopartikel i fokus for en biomagnifier, de observerede både optiske og fluorescerende billeder af prøven af ​​interesse. Li et al. derefter beregnet fældestivheden af ​​partiklen i realtid ved hjælp af standard optisk pincet. Evnen til at manipulere en enkelt nanopartikel uden kontakt og præcist via optik vil være nyttig til at samle velregulerede nanostrukturer. Da Li et al. numerisk undersøgt billeddannelsesmekanismen og fangststivhed af bioforstørrere ved hjælp af 3D-simulering og COMSOL-software. De observerede subdiffraktionsgrænsen for lysfokusering som følge af en kombineret "fotonisk nanojet" -effekt og sammenhængende interferensforbedring af spejlet.

Begrænsninger af metoden omfattede billeddannelse aberration og forvrængning på grund af de inhomogene intracellulære strukturer i den naturlige biomagnifier, sammenlignet med dielektriske mikrosfærer med ensartede brydningsindekser. Heldigvis, intracellulære materialer var optisk gennemsigtige for synligt og nær-infrarødt lys, og de optiske interaktioner var relativt svage inde i en enkelt celle. Intracellulære aktiviteter kan også ændre den delvise brydningsindeksfordeling i en celle for at forårsage lysforvrængning under fangst og billeddannelse, men de fleste intracellulære aktiviteter var ultrahurtige og påvirkede ikke billeddannelsesordningen.

På denne måde, Yuchao Li og kolleger udviklede en ny eksperimentel billeddannelsesteknik og verificerede de eksperimentelle muligheder med FEM -simuleringer. Li et al. integrerede optiske nanoskoper og nanotweezere i en enkelt enhed til billedbehandling og manipulation af nanostrukturer samtidigt for første gang i det nuværende arbejde. De fremmede opløsningen af ​​teknikken til 100 nm og foreslog en etiketfri billeddannelsesprocedure. Forskerne forestiller sig den levende biomagnifier for at åbne nye muligheder inden for superopløsende billeddannelse, realtidsføling og præcis nano-samling af bionanomaterialer til dannelse af nanoarchitectures af interesse.

© 2019 Science X Network