Miniscope3D system oversigt. Sammenlignet med tidligere Miniscope og MiniLFM designs, vores Miniscope3D er lettere og mere kompakt. Vi fjerner Miniscopes rørlinse og placerer en 55 μm tyk optimeret fasemaske ved blændestoppet (Fourier-planet) på GRIN-objektivet. Et sparsomt sæt (64 pr. dybde) af kalibreringspunktspredningsfunktioner (PSF'er) fanges ved at scanne en 2,5 μm grøn fluorescerende perle i hele volumen. Vi bruger dette datasæt til at forudberegne en effektiv fremadrettet model, der nøjagtigt fanger feltvarierende aberrationer. Den fremadrettede model bruges derefter til iterativt at løse et omvendt problem for at rekonstruere 3D-volumener fra enkeltskuds 2D-målinger. 3D-rekonstruktionen her er af en fritsvømmende fluorescensmærket tardigrad. Kredit:Light:Science &Applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Et miniature fluorescensmikroskop, der vejer mindre og samtidig tilbyder høj opløsning sammenlignet med eksisterende enheder, vil have en række anvendelser inden for systembiologi. Eksisterende miniature fluorescensmikroskoper er en standardteknik inden for biovidenskab, men de tilbyder kun todimensionel (2-D) information. I en ny rapport nu på Nature Light:Videnskab og applikationer , Kyrollos Yanny, Nick Antipa og et team af forskere i Joint Graduate Program in Bioengineering, Elektroteknik og computervidenskab ved University of California, Berkeley og Universite libre de Bruxelles, Belgien, udviklet et enkeltskuds 3-D fluorescensmikroskop. De konstruerede den nye enhed kendt som Miniscope3D ved at erstatte rørlinsen på et konventionelt 2-D miniskop med en optimeret multifokal fasemaske ved objektivets blændestop. Ved at bruge enheden, Yanny og Antipa et al. optisk registreret neural aktivitet i frit bevægende dyr og i langsigtede in situ billedbehandlingsapplikationer i inkubatorer og i lab-on-a-chip enheder.
Miniature fluorescensbilleddannelse og tekniske innovationer
Miniature fluorescensmikroskoper er vigtige i systembiologi til optiske optagelser af neural aktivitet hos fritgående dyr, langsigtet in situ billeddannelse i inkubatorer og medicinsk udstyr. Sådanne mikroskoper er også kendt som "miniskoper" og er lavet af 3-D printede dele, selvom de tilbyder 2-D fluorescensbilleddannelse alene. Enkeltbillede-metoder kan muliggøre hurtigere optagelseshastigheder og en tidsmæssig opløsning begrænset af kameraets billedhastighed. For eksempel, et tidligere udviklet miniature lysfeltmikroskop (MiniLFM) kan behandle neural aktivitet med en optimeret algoritme. I dette arbejde, Yanny et al. udviklet et 3-D miniskop for at opnå højere opløsning med lettere vægt sammenlignet med eksisterende teknikker. Holdet testede de mikroskopiske egenskaber ved at afbilde fluorescerende opløsningsmål såvel som frit svømmende biologiske prøver og musehjernevæv. De validerede de rekonstruerede resultater i sammenligning med to-fotonmikroskopi for at forstå grænserne for den nye teknik.
Fasemaskefremstilling med nanoscribe. (a) Rektangulær syning fører til sømme (sorte linjer), der går gennem de mange mikrolinser, hvorimod adaptiv syning sætter sømmene ved grænserne af mikrolinserne for at afbøde artefakter. (b) Sammenligning mellem designet og eksperimentelle PSF'er i nogle få prøvedybder, viser god enighed, med let forringelse i kanten af volumen. Kredit:Light:Science &Applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
For at opnå billeddannelse af høj kvalitet i en lille, lavvægts enhed, Yanny et al. placerede fasemasken (hvor lys, der passerer gennem masken, vil gennemgå et faseskift proportionalt med tykkelsen af materialet) i Fourier-rummet for at reducere beregningsbyrden og forbedre kompaktheden. De tilføjede 3-D-egenskaber til 2-D-miniskopet på bekostning af et lille tab i lateral opløsning og lavere signal-til-støj-forhold. Algoritmen forenede den optiske teori med komprimeret sensing for at fremstille de optimerede fasemasker. Teknikken lettede en ny miniature 3-D mikroskoparkitektur med højere opløsning, open source-design, fabrikation af højere kvalitet og et effektivt kalibreringsskema eller rekonstruktionsalgoritme.
Karakterisering af beregningsmikroskopet og undersøgelse af musehjernen
Holdet testede ydeevnen af beregningsmikroskopet ved hjælp af prøver af stigende kompleksitet til at fange 3-D dynamiske optagelser. De målte den laterale opløsning i forskellige dybder ved at afbilde et fluorescerende opløsningsmål. De validerede derefter nøjagtigheden af deres resultater ved hjælp af to-fotonmikroskopi. For eksempel, Miniscope3D kunne nøjagtigt gendanne alle rekonstruerede billeder af den 3-D fluorescerende perleprøve efter behandling. De viste potentialet ved metoden ved hjælp af neurobiologiske prøver, hvor grønt fluorescerende proteinmærkede regioner udtrykte sparsomme populationer af neuroner i hele prøven. De rekonstruerede billeder opnået fra forskellige dele af hippocampus viste dendritter, der løb hen over overfladen sammen med individuelle cellelegemer. Da Yanny et al. næste undersøgte dynamiske prøver af frisvømning, grønfarvede tardigrader (også kendt som vandbjørne), de rekonstruerede billeder viste effektiviteten af Miniscope3D-billeddannelse til at spore frit bevægende biologiske organismer ved høj opløsning i rum-tid.
Eksperimentel karakterisering. (a) Rekonstruktioner af et fluorescerende USAF-mål ved forskellige aksiale positioner for at bestemme den dybdeafhængige laterale opløsning. Vi genvinder en opløsning på 2,76 μm over det meste af dybderne på 390 μm, med det værste tilfælde på 3,9 μm (stiplede orange linjer markerer de indsatte steder, og gule felter i indsætningerne angiver de mindst løste grupper). Bemærk, at opløsningsmålet har diskrete opløsningsniveauer, der resulterer i spring i dataene, og at opløsning her refererer til afstanden mellem søjlerne, ikke linjeparets bredde. (b) Rekonstruktion af en 160 μm tyk prøve af 4,8 μm fluorescerende perler sammenlignet med et to-foton 3D-scanningsbillede (maksimal intensitetsprojektioner i yx- og zx-planerne er vist). Vores system registrerer de samme funktioner, med en lidt større lateral pletstørrelse. Kredit:Light:Science &Applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Rekonstruktion af GFP-mærkede neuroner i 300 µm tykt optisk ryddet musehjerneskive, der demonstrerer enkelt neuronopløsning og klart opløste dendritter, der løber aksialt over volumen. Kredit:Light:Science &Applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
3-D rekonstruktion af frit svømmende tardigrader. (Venstre) Rådata. (Til højre) Rekonstruktion af frit bevægelige SYBR-grønfarvede tardigrader. Kredit:Kredit:Light:Science &Applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Applikationer og tilgængelighed af enheden
De fleste anvendelser af Miniscope3D vil ligne 3-D mikroskopi og MiniLFM (miniature lysfeltsmikroskopi), som betragtes som guldstandarden for single-shot miniature 3-D fluorescensbilleddannelse. Sammenlignet med MiniLFM, imidlertid, den nye Miniscope3D-metode tilbød flere forbedringer, herunder multifokale linser, bedste tilfælde lateral opløsning og en 10-dobling af det anvendelige målevolumen. Den forbedrede ydeevne ankom i en hardwarepakke, der var mindre end MiniLFM med en lettere vægt til frit at observere organismer i bevægelse. Metoden muliggjorde yderligere eksperimentel rekonstruktion med eller uden spredning for musehjernevæv ved enkelt neuronopløsning. Teamet vil optimere eksisterende grænser for enheden, herunder spredning, for yderligere ansøgninger.
Ved at bygge videre på en populær open source miniskopplatform, Yanny et al. givet tilgængelighed til Miniscope3D-designet. På denne måde, Kyrollos Yanny, Nick Antipa og kolleger leverede en 3-D prototype som en mulighed for at opgradere de 2-D miniskoper, der i øjeblikket er i brug på tværs af 450 laboratorier. De eksperimentelle resultater var i god overensstemmelse med det teoretiske design og analyse for at tjene som en brugbar ramme for tilpassede single-shot 3-D systemer.
© 2020 Science X Network