Forskere fanger de første 3D super-opløsningsbilleder i levende mus

Forskere har udviklet en ny mikroskopiteknik, der kan tage 3-D superopløsningsbilleder af subcellulære strukturer fra omkring 100 mikrometer dybt inde i biologisk væv, inklusive hjernen. Ved at give videnskabsfolk et dybere indblik i hjernen, metoden kunne hjælpe med at afsløre subtile ændringer, der opstår i neuroner over tid, under læring, eller som følge af sygdom.

Den nye tilgang er en udvidelse af stimulated emission depletion (STED) mikroskopi, en banebrydende teknik, der opnår opløsning i nanoskala ved at overvinde den traditionelle diffraktionsgrænse for optiske mikroskoper. Stefan Hell vandt 2014 Nobelprisen i kemi for at udvikle denne super-opløsning billedbehandlingsteknik.

I Optica , forskerne beskriver, hvordan de brugte deres nye STED-mikroskop til at afbilde, i super opløsning, 3D-strukturen af ​​dendritiske rygsøjler dybt inde i hjernen på en levende mus. Dendriske rygsøjler er små fremspring på de dendritiske grene af neuroner, som modtager synaptiske input fra naboneuroner. De spiller en afgørende rolle i neuronal aktivitet.

"Vores mikroskop er det første instrument i verden til at opnå 3-D STED superopløsning dybt inde i et levende dyr, " sagde lederen af ​​forskerholdet Joerg Bewersdorf fra Yale School of Medicine. "Sådanne fremskridt inden for deep-tissue imaging-teknologi vil give forskere mulighed for direkte at visualisere subcellulære strukturer og dynamik i deres oprindelige vævsmiljø, " sagde Bewersdorf. "Evnen til at studere cellulær adfærd på denne måde er afgørende for at opnå en omfattende forståelse af biologiske fænomener for biomedicinsk forskning såvel som for farmaceutisk udvikling."

Går dybere

Konventionel STED-mikroskopi bruges oftest til at afbilde dyrkede celleprøver. At bruge teknikken til at afbilde tykt væv eller levende dyr er meget mere udfordrende, især når superopløsningsfordelene ved STED udvides til den tredje dimension for 3-D-STED. Denne begrænsning opstår, fordi tykt og optisk tæt væv forhindrer lys i at trænge dybt ind og i at fokusere korrekt, og dermed forringe STED-mikroskopets superopløsningsevner.

For at overkomme denne udfordring, forskerne kombinerede STED-mikroskopi med to-foton excitation (2PE) og adaptiv optik. "2PE muliggør billeddannelse dybere i væv ved at bruge nær-infrarøde bølgelængder i stedet for synligt lys, " sagde Mary Grace M. Velasco, avisens første forfatter. "Infrarødt lys er mindre modtageligt for spredning og, derfor, er bedre i stand til at trænge dybt ind i vævet."

Forskerne tilføjede også adaptiv optik til deres system. "Brugen af ​​adaptiv optik korrigerer forvrængning af lysets form, dvs. de optiske aberrationer, der opstår ved billeddannelse i og gennem væv, " sagde Velasco. "Under billeddannelse, det adaptive element modificerer lysbølgefronten på den stik modsatte måde, som vævet i prøven gør. Afvigelserne fra det adaptive element, derfor, udligne aberrationerne fra vævet, skabe ideelle billeddannelsesforhold, der gør det muligt at genskabe STED-superopløsningskapaciteterne i alle tre dimensioner."

At se ændringer i hjernen

Forskerne testede deres 3-D-2PE-STED-teknik ved først at afbilde velkarakteriserede strukturer i dyrkede celler på et dækglas. Sammenlignet med at bruge 2PE alene, 3-D-2PE-STED opløste volumener mere end 10 gange mindre. De viste også, at deres mikroskop kunne løse fordelingen af ​​DNA i kernen af ​​musehudceller meget bedre end et konventionelt to-foton mikroskop.

Efter disse tests, forskerne brugte deres 3-D-2PE-STED mikroskop til at afbilde hjernen på en levende mus. De zoomede ind på en del af en dendrit og løste 3D-strukturen af ​​individuelle rygsøjler. De afbildede derefter det samme område to dage senere og viste, at rygsøjlens struktur faktisk havde ændret sig i løbet af denne tid. Forskerne observerede ingen ændringer i neuronernes struktur i deres billeder eller i musenes adfærd, der kunne tyde på skader fra billeddannelsen. Imidlertid, de planlægger at studere dette yderligere.

"Dendritiske rygsøjler er så små, at det uden superopløsning er svært at visualisere deres nøjagtige 3D-form, endsige ændringer i denne form over tid, " sagde Velasco. "3-D-2PE-STED giver nu midlerne til at observere disse ændringer og til at gøre det ikke kun i de overfladiske lag af hjernen, men også dybere inde, hvor flere af de interessante forbindelser sker."