Ny metode til masseproduktion af rekombinante proteiner bruger mono-natriumglutamat

Masseproduktion af rekombinante proteiner ved hjælp af gærcelle-"fabrikker" kræver methanol, en forbindelse, der kræver sikker håndtering, indebærer risiko for at antænde, og nogle gange producerer skadelige biprodukter. Forskere ved Institut for Biokemi (BC), Indian Institute of Science (IISc), har nu udviklet en alternativ sikrere proces, der i stedet er afhængig af et almindeligt fødevaretilsætningsstof kaldet mono-natriumglutamat (MSG).

Rekombinante proteiner, såsom vaccineantigener, insulin og monoklonale antistoffer, masseproduceres ved at dyrke modificerede bakterielle, virale eller pattedyrceller i store bioreaktorer. Den mest udbredte organisme er gæren Pichia pastoris (nu kaldet Komagataella phaffii). Den indeholder en unik promotor - en specifik genregion, som kan aktiveres af methanol. Denne promotor koder for et enzym kaldet alkoholoxidase (AOX).

For at masseproducere et rekombinant protein splejses genet, der koder for dette protein, ind i gærgenomet lige ved siden af ​​AOX-promotoren. Gærcellerne tilføres derefter glycerol eller glucose som kulstofkilde. Når der er dannet nok celler, tilsættes methanol, som derefter aktiverer AOX-promotoren, og cellerne begynder at producere det rekombinante protein i rigelige mængder.

De fleste industrier bruger denne methanol-inducerede proces til at producere rekombinante proteiner. Men methanol er meget brandfarligt og farligt, hvilket kræver strenge sikkerhedsforanstaltninger, påpeger PN Rangarajan, professor ved BC og tilsvarende forfatter til undersøgelsen offentliggjort i Microbial Cell Factories . Methanol metaboliseres også for at danne hydrogenperoxid, som kan inducere oxidativt stress i gærcellerne eller beskadige de rekombinante proteiner.

For at løse dette problem, Trishna Dey, en tidligere ph.d. studerende på BC, begyndte at lede efter alternativer. Efter en omfattende søgning fandt holdet, at mono-natriumglutamat (MSG), et USFDA godkendt fødevaretilsætningsstof, kan aktivere en anden promotor i gærgenomet, der koder for et enzym kaldet phosphoenolpyruvat carboxykinase (PEPCK). Aktivering af denne promotor med MSG førte til proteinproduktion svarende til methanolaktivering af AOX-promotoren.

At optimere cellekulturmediet til denne nye og utestede proces var udfordrende, siger Neetu Rajak, førsteforfatter og ph.d. studerende på BC. I lang tid voksede gærcellerne dårligt i rystekolber og producerede meget lidt rekombinant protein. "Der var et tidspunkt, hvor vi næsten gav op, fordi vi troede, det ikke ville fungere," husker Rangarajan.

Gruppen fandt til sidst ud af, at det ikke var nok at bruge MSG alene. Vedanth Bellad og Yash Sharma, projektassistenter hos BC og medforfattere, forklarer, at de forsøgte at supplere kulturen med forskellige andre forbindelser, indtil man til sidst gjorde tricket:ethanol.

Tilsætning af ethanol hjalp cellerne med at vokse hurtigere, hvilket øgede biomassen og mængden af ​​produceret rekombinant protein. Ethanol er også sikrere for gærceller sammenlignet med methanol, da det ikke producerer giftige biprodukter, når det nedbrydes.

For at teste deres proces forsøgte holdet at producere SARS-CoV-2-receptorbindingsdomænet - et meget brugt vaccineantigen, der med succes er blevet udtrykt i gær- og pattedyrceller. De fandt ud af, at deres nye ekspressionssystem producerede dobbelt så meget antigen sammenlignet med den methanol-inducerede proces.

Forskerne håber, at dette nye og oprindelige ekspressionssystem kan bruges i bioteknologiske industrier til at masseproducere værdifulde proteiner, herunder mælke- og ægproteiner, babykosttilskud og nutraceuticals, bortset fra terapeutiske molekyler.