Negativ farvningsmetode. (a) Virioner er bundet til kulstofstøttefilmen. (b) En opløsning indeholdende tungmetaller (negativt farvningsreagens) dryppes på filmen. (c) Overskydende opløsning fjernes, og prøven tørres. (d) Transmissionselektronmikroskopi (TEM) af tungmetal-coatede virioner producerer (e) et omvendt kontrastbillede af virussen. Kredit:Koichi Sahiro et al., Scientific Reports (2022). DOI:10.1038/s41598-022-11405-3
At se er at tro – eller, for videnskabsmænd, begyndelsen på forståelse. Forskere kan visualisere atomisk små detaljer med transmissionselektronmikroskopi (TEM) ved at sende elektroner gennem prøven og fange deres interaktioner for at danne et billede. Men sådanne bittesmå eksemplarer kan unddrage sig elektronerne, så de skal specialbehandles med tungmetaller for at sikre interaktioner. For at se vira, for eksempel, er den nuværende standard at overhælde virusprøven med en opløsning indeholdende et radioaktivt, stramt kontrolleret stof kaldet uranylacetat.
De resulterende billeder er klare, men processen med at fremskaffe og opbevare den nødvendige radioaktive tungmetalopløsning kan være en kompliceret barriere for forskere, ifølge Masahiro Sadakane, professor i anvendt kemi ved Hiroshima University's Graduate School of Advanced Science and Engineering. Sadakane og hans team fandt for nylig ud af, at en ikke-radioaktiv behandling kan producere de samme klare, detaljerede billeder uden uranylacetats bureaukratiske ballade.
De offentliggjorde deres resultater den 12. maj i Scientific Reports .
"Iagttagelse af viral morfologi er essentiel i virologi, hvor TEM er den mest udbredte teknik, fordi det tillader direkte visualisering på nanometerskalaen, men det kræver i øjeblikket tunge element-holdige negative farvningsreagenser," sagde Sadakane, tilsvarende forfatter på papiret. "Nye, ikke-radioaktive forbindelser til enkle, hurtige og klare observationer ved hjælp af traditionel TEM er påkrævet over hele verden."
Et nuværende kommercielt tilgængeligt alternativ til det radioaktive uranylacetat er et materiale kendt som "Keggin-type" phosphowolframsyre. Molekylet består af en central enhed af et fosfat og fire oxygenatomer, tæt omgivet af wolfram og mere oxygen. Selvom det ikke er radioaktivt, er molekylet meget surt og skal neutraliseres før brug, ifølge Sadakane. Han bemærkede også, at de billeder, det producerer, er mindre klare end dem, der er lavet med uranylacetat. På trods af disse ulemper tilhører reagenset en stor familie af lignende – og muligvis bedre – forbindelser.
"Vi har undersøgt phosphowolframatforbindelser og tidligere rapporteret, at 'Preyssler-typen' kan bruges som et negativt farvningsreagens til at observere en fin struktur af bakterier," sagde Sadakane.
"Molekyler af Preyssler-typen omfatter også wolfram, oxygen og fosfat, men de er strukturelt arrangeret omkring en indkapslet positivt ladet ion, såsom natrium eller calcium. De har en anden struktur end forbindelserne af Keggin-typen, hvilket resulterer i et meget mere stabilt molekyle. der produceres som et kaliumsalt."
Forskerne brugte Preyssler-type phosphowolframater til at farve og afbilde tre typer bakterielle vira (fager), som inficerer bakterier. De morfologiske strukturer af disse fag er allerede veldokumenterede og giver en pålidelig reference til at kontrollere klarheden af billeder opnået i deres undersøgelse.
"Vores resultater indikerer, at phosphowolframater af Preyssler-typen er gode negative farvningsreagenser til virusobservationer," sagde Sadakane. "De er nemme at bruge, da de ikke er radioaktive og ikke behøver justering for pH-niveauer, og de giver klare billeder."
Forskerne planlægger at bygge videre på deres resultater for at udvikle en række ikke-radioaktive negativ-farvningsreagenser til at observere andre vira, såvel som små organiske partikler såsom proteiner og mere, ifølge Sadakane. + Udforsk yderligere