Komponenter af Lysis Buffers

Lyse er et ord, der kommer fra græsk og betyder blot "at splitte" eller "at briste". Helt klart gælder betingelserne for, hvad der sker med celler i en lysisbuffer, en løsning, der bringer dem åbne for at udtrække deres indhold. Forskere bruger lysisbuffere ved ekstraktion af DNA eller proteiner fra celler til analyse, især i tilfælde af bakterier. Typen celle lysis buffer varierer afhængigt af typen af ​​eksperiment, selvom følgende er nogle fælles valg.

TL; DR (for længe, ​​ikke læst)

Lysis buffere bidrager til bryde åbne celler, så deres indhold kan fås eller fjernes. Nogle eksempler omfatter salte, rengøringsmidler, chelateringsmidler og inhibitorer og nogle alkaliske kemikalier.

Buffer og Salt

Buffere stabiliserer pH, mens cellerne splitter. Tris-HCL står som et af de mest almindelige kemikalier til buffering ved pH 8. HEPES er et andet almindeligt buffer kemikalie i disse eksperimenter. Natriumchloridsalt kan også øge ionstyrken, den totale koncentration af opløste stoffer uden for cellerne. Dette sidste punkt har en vis betydning, da vand kan diffundere over cellemembraner fra områder med lavt opløst koncentration til områder med høj opløsningsmiddelkoncentration.

Opløsningsmidler

Rengøringsmidler løser cellemembraner, så cellens indhold kan undslippe . Den har og amfipatiske molekylære struktur (dvs. molekyler med en ende, der let vekselvirker med vandmolekyler, medens den anden hydrofobe eller "vand-frygtende" ende ikke er). De kan opløse fedtstoffer ved at danne miceller, små klynger, hvor de vaskende molekylers hydrofobe haler peger indad mod fedtmolekylerne. Fælles vaskemidler omfatter natriumdodecylsulfat eller SDS, NP-40 og tritonX.

Chelateringsmidler og inhibitorer

Lysisbuffere indeholder typisk også chelateringsmidler som ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) eller ethylenglycoltetraeddikesyre syre (EGTA). Disse kemikalier binder til metalioner med to positive ladninger (fx magnesium og calcium) og derved gør dem utilgængelige til andre reaktioner. Mange DNA'er (proteiner der tygger op DNA) og proteaser (proteiner, der opskærer andre proteiner) har brug for magnesiumioner til at fungere, så ved at fratage dem denne nøgle ingrediens hjælper EDTA og EGTA med at reducere niveauet af protease eller DNAse-aktivitet. De udelukker dog ikke helt, og nogle proteaser er ikke afhængige af magnesiumkofaktorer, så lysisbuffere indbefatter undertiden også kemikalier kaldet proteasehæmmere, som binder til proteaser og forhindrer dem i at fungere korrekt.

Alkalisk lysis

Alkalisk lysis, en meget almindelig teknik til rensning af plasmider fra bakterier, involverer tre løsninger. Den første indeholder glucose, tris-HCL buffer, EDTA og RNAses. Glukosen skaber en høj opløsningskoncentration uden for bakterierne, så de bliver en smule blabby, hvilket gør dem lettere at lyse. EDTA- og tris-HCL-funktionen som allerede beskrevet, mens RNAse vil tygge op en hvilken som helst RNA inde i cellen for at få det ud af vejen. Den anden løsning lyser faktisk cellerne. Denne indeholder SDS-detergent og NaOH, som hæver pH til 12 eller derover, denatureringsproteiner inde i cellen og forårsager, at DNA adskilles i enkelte tråde. Den tredje opløsning indeholder kaliumacetat for at genoprette pH til et mere neutralt niveau, så plasmid-DNA-strengene kan komme sammen igen. I mellemtiden klumper de denaturerede proteiner op og bundfældes, mens dodecylsulfationerne kommer sammen med kaliumionerne til dannelse af en uopløselig forbindelse, som også udfældes fra opløsningen.