Cellulær mikroRNA-detektion med mirakler

MikroRNA'er (miRNA'er) er korte ikke-kodende regulatoriske RNA'er, der kan undertrykke genekspression post-transkriptionelt og bruges derfor i stigende grad som biomarkører for sygdom. Påvisning af miRNA'er kan være besværligt og dyrt, da de kræver amplifikation, mærkning og radioaktive sonder. I en nylig rapport offentliggjort den Videnskabens fremskridt , Arun Richard Chandrasekaran og medarbejdere ved RNA Instituttet og Institut for Biologiske Videnskaber, ved University of Albany, State University of New York, rapporteret på et enkelt trin, ikke-enzym mikroRNA detektionsassay ved hjælp af konformationelt ikke-responsive DNA nanoswitches.

Forskerne kaldte analysen 'mirakler, ' for at forkorte 'mikro-RNA aktiveret betinget looping af konstruerede switches'. Assayet demonstrerede subattomol- og enkeltnukleotidspecificitet ved anvendelse af en agarosegelelektroforeseaflæsning. I forsøgene, de påviste cellulære mikroRNA'er fra RNA-ekstraktioner opnået fra differentierende muskler på nanogram-skalaen. Forskerne præsenterede et omkostningseffektivt eksperimentelt setup til at detektere miRNA'er inden for en times tidsramme for at give et overbevisende alternativ til de eksisterende metoder til kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) og Northern blotting for at kvantificere de regulatoriske genetiske materialer.

miRNA'er kan regulere mange biologiske processer under normal fysiologisk udvikling og sygdom ved at påvirke celleproliferation, differentiering og apoptose in vivo. Ekspressionen af ​​miRNA'er kan kvantificeres i væv, celler og kropsvæsker som stabile biomarkører for cellulære hændelser og sygdomsdiagnose, fremhæve vigtigheden af ​​deres opdagelse. Alligevel, miRNA-detektion er udfordrende på grund af lav overflod, lille størrelse og ligheder i rækkefølge. Biomolekylerne udgør cirka 0,01 procent af det totale RNA-indhold, og individuelle mRNA-kopier pr. celleområde kan variere meget. Derudover miRNA'er i en familie kan variere med et enkelt nukleotid, mens specifikke miRNA'er kan reguleres under sygdom og regelmæssig cellulær funktion. Som resultat, påvisningsstrategierne for miRNA kræver høj specificitet og evnen til korrekt at identificere nogle få molekyler fra en prøve, der er rigeligt med dominerende RNA-molekyler.

Traditionelle metoder til påvisning af miRNA omfatter Northern blotting, kvantitativ revers-transkriptionspolymerasekædereaktion (qRT-PCR), næste generations sekventering og mikroarray-baseret hybridisering for at adskille miRNA-signalet fra støj. Af de angivne metoder, Northern blotting kan direkte identificere native miRNA'er, mens andre er afhængige af yderligere mærkningsmetoder eller trinvis amplifikation, øger omkostningerne, kompleksitet og ydelse af detektion. For eksempel, innovative DNA-nanostrukturer kan bruges til miRNA-detektion, hvor forskellige forskningsgrupper tidligere har kombineret nanostrukturer med nanopartikler, hybridiseringskædereaktioner og overgangsmetal dichalcogenid nanoplader for at muliggøre processen.

I nærværende arbejde, Chandrasekaran et al. udviklet et relativt simpelt DNA-baseret apparat til at løse en kompleks biomedicinsk udfordring. I miracles assay, forskerne brugte et 'smart reagens' sammensat af rationelt designede DNA-nanoswitches til enkel og omkostningseffektiv native miRNA-detektion uden brug af specialudstyr i laboratoriet. DNA nanoswitches blev oprindeligt designet som værktøjer til enkeltmolekyle biofysiske eksperimenter og senere anerkendt for deres evne til at detektere og kvantificere biomolekylære interaktioner ved hjælp af gelelektroforese. Tidligere forskningssamarbejde fra det samme forskerhold fokuserede på molekylær detektion for at kvantificere proteinniveauer og detektere syntetiske DNA-sekvenser som et proof-of-concept.

Det nuværende arbejde udvidede på foreløbige undersøgelser og koncepter for at producere brugerklar multiplekset miRNA-detektion og kvantificering. Forskerne analyserede nanogram af cellulære RNA-ekstrakter i en kort tidsramme ved hjælp af en eksperimentel opsætning bygget ved hjælp af almindelige laboratorieforsyninger. De designede DNA-nanoswitchen som en lineær dupleks, der dannede en løkke i nærvær af mål-miRNA-molekylet. For at konstruere nanoswitchen, Chandrasekaran et al. brugte DNA-origami-tilgangen ved at hybridisere korte oligonukleotider komplementære til et enkeltstrenget DNA-stillads.

De designede to fjerne "detektor"-strenge med udhæng, der var komplementære til forskellige segmenter af mål-miRNA'et. Når miRNA'et genkendte og bandt til konstruktionen, kontakten rekonfigureret fra den lineære "slukket"-tilstand til den sløjfede "til"-tilstand. De kvantificerede de to tilstande ved hjælp af standard agarosegelelektroforese for at detektere signalet, der stammer fra den sløjfede nanoswitch. Signalet blev kun forstærket af et enkelt miRNA af interesse, resultaterne sammenlignet positivt med fluorescensresonansenergioverførselsteknikken (FRET).

For at validere konceptet, holdet af forskere valgte et let-7b-mål miRNA på grund af dets meget konserverede familie på mere end et dusin-relaterede miRNA'er, der varierede med et eller flere nukleotider. Disse miRNA'er var velegnede på grund af deres kritiske rolle i biologiske funktioner og dysregulering i flere menneskelige sygdomme. For at eliminere krydstale og støj mellem nanoswitchen og målet - hvilket førte til reduceret signalintensitet sammenlignet med et perfekt match, forskerne redesignede rationelt nanoswitchene. For at opnå perfekt specificitet, de destabiliserede interaktionen på den side, der indeholdt uoverensstemmelsen. Resultaterne af undersøgelsen illustrerede høj specificitet af det således udviklede assay, giver et svar på en nøgleudfordring i miRNA-detektion, der kulminerede fra et højt signal/støj-forhold.

Den lave overflod af miRNA'er krævede også høj påvisningsfølsomhed, hvilket forskerne opnåede ved at optimere protokollen. De udførte derefter lignende eksperimenter for to andre varianter af miRNA'er (miR-15 a og miR-206), resulterer i subattomol til enkelt-attomol niveauer af påvisning. For eksempel, for en lav koncentration af en målprøve (6 pM), signalet steg i 4 timer, med få ændringer ud over denne tidsramme.

miRNA'er studeres også typisk i cellekulturer, vævsprøver og kropsvæsker og let behandlet til at indsamle totale RNA'er i mikrogramskalaen, sammen med en underfraktion af lille RNA. For det, Chandrasekaran et al. brugte myoblastceller som et surrogatmodelsystem for muskeldifferentiering, med miR-206 som det primære mål. Under cellekultur, de identificerede miRNA'er i differentierende skeletmuskler, hvor molekylet miR-206 var signifikant opreguleret under sen differentiering. Da forskerne høstede de udifferentierede og differentierede muskelceller for at udvinde små RNA'er, de bekræftede celledifferentiering ved hjælp af Western blots og udførte immuncytokemi for henholdsvis tidlige og sene differentieringsmarkører myogenin (Myog) og myosin tung kæde (MHC). Da individuelle miRNA'er udgør dele-per-million niveau efter masse af samlede RNA'er, at opdage miRNA'er er lige så udfordrende som at finde en nål i en høstak. For at validere analysen til biologisk påvisning, derfor, Chandrasekaran et al. startede med den mindre komplekse lille RNA-subfraktion. Hvor forskerne ved hjælp af miR-206-mål-nanoswitchen observerede en progressiv stigning i miR-206-ekspression i små RNA'er mellem udifferentierede prøver og prøver differentieret i 1-4 dage.

Da flere mRNA'er også kan ændre deres ekspression under forskellige cellulære eller sygdomsstadier, fænomenet krævede yderligere detektionsmuligheder. For at opnå dette i den eksperimentelle opsætning, Chandrasekaran et al. brugte programmerbarheden af ​​nanoswitches og udviklede et multipleksingssystem, der er i stand til at detektere flere miRNA'er fra den samme prøve. De placerede detektorstrengene på de ønskede steder i DNA-stilladset, hvilket resulterer i loops af forskellig størrelse, når de er bundet til target miRNA'et. Sløjfestørrelsen af ​​nanoswitchen bestemte således gelmigreringen, resulterer i et unikt bånd på gelen til nøjagtig detektion. Til eksperimentet, forskerne valgte fire miRNA'er til stede i muskelceller; miR-206, miR-125b, miR-24 og miR-133-3p og en negativ kontrol miRNA; miR-39 specifikt for arten Caenorhabditis elegans.

Inden for 50 ng af små RNA'er, forskerne opdagede de fire miRNA'er på forskellige ekspressionsniveauer, mens den bekræfter ingen detektering med den negative kontrol. Multiplexing-strategien gjorde det muligt for forskerne direkte at sammenligne miRNA-niveauer i en enkelt prøve, uden mærkning eller amplifikation. I alt, arbejdet gav et yderligere skridt i retning af at udvide gennemstrømningen af ​​miRacles-analysen. Muligheden kan udvides til også at rumme flere miRNA'er pr. switch.

På denne måde Chandrasekaran et al. væsentligt bevæget sig fremad fra deres foreløbige proof-of-concept-detektion af syntetiske DNA-sekvenser; at etablere, karakterisere og optimere et brugsklart miRNA-detektionsassay med biologiske ekstrakter. Det demonstrerede arbejde var et første eksempel på at bruge DNA nanoswitches til at detektere miRNA'er fra en ægte biologisk prøve. Mens ydeevnen af ​​miRNA-analysen var konkurrencedygtig sammenlignet med andre almindeligt anvendte teknikker, selektiviteten af ​​1 nukleotid set i det foreliggende arbejde var vanskelig at opnå med eksisterende metoder. Følsomheden af ​​mirakler overgik også Northern blotting og mikroarrays. Analysen kunne måle miRNA'er uden behov for amplifikation, med enklere protokoller og uden den tilføjede fejl ved ekstra prøvebehandling. Protokollen blandede simpelthen nanoswitchene med prøvevæsken til gelelektroforese, at producere resultater af høj kvalitet i laboratoriet. Forskningsarbejdet kan potentielt overføres fra biologiske til kliniske prøver for at diagnosticere og overvåge sygdom.

Vigtigere, nærværende arbejde er på linje med det bredere begreb sparsommelig videnskab; en lovende vision om omkostningseffektiv videnskab, der allerede har produceret billige løsninger til blodcentrifugering og vandrensningsteknikker inden for biomedicinsk teknik. Chandrasekaran et al. sigter mod fortsat at bidrage til den nye tendens inden for videnskab, ved at forstyrre det eksisterende omkostnings-/ydelsesforhold for at give bred skala adgang til simple miRNA-detektionsmetoder med bland-og-læs smarte reagenser.

© 2019 Science X Network