Sådan isoleres MRNA fra en Cell

En celles genetiske plan er kodet inden for dets genetiske materiale eller DNA. Da DNA'et aldrig efterlader cellens kerne, for at denne information skal komme ind i cytoplasmaet, hvor der findes andre proteiner og biokemiske komponenter, er det nødvendigt først at transkribe DNA'et til messenger RNA (mRNA eller poly (A) RNA). Dette mRNA bliver så oversat til proteiner, der udfører mange funktioner i cellen. For at detektere eller kvantificere meget sjældne mRNA'er, lave prober til mikroarrays eller konstruere biblioteker af komplementære DNA-molekyler, skal mRNA isoleres. Imidlertid er total RNA (dvs. al RNA i en celle) -ekstraktion og efterfølgende mRNA-isolering ikke gensidigt udelukkende processer; Den første skal udføres for at udvide mRNA.

Isolering af mRNA fra total RNA

TRIzol homogenisering: Total RNA indbefatter alt mRNA, transfer RNA, ribosomalt RNA og andre ikke-kodende RNA'er . For at adskille disse fra andre cellulære komponenter bliver cellen først åbnet for at frigive dens indhold. Dette gøres ved at resuspende celler pelleteret ved centrifugering (spinning ved høje hastigheder) i TRIzol Reagent (Life Technologies). Andre versioner af TRIzol (som Ambions TRI-reagens) fungerer på samme måde.

Total RNA-isolering: En serie centrifugeringer bruges til at adskille de forskellige komponenter (proteiner, DNA, RNA) fra cellen til lag eller faser , inden for suspensionen. Den øverste gulfarvede fase består af fedt og kan kasseres. Den ønskede fase er tonet rødt, indeholder det totale RNA og bevares. Efter udførelse af en phenol-chloroformekstraktion og en serie af alkoholvaske under anvendelse af isopropanol og ethanol kan RNA'et pelleteres til mRNA-isolering. Tilføj RNase-hæmmere for at forhindre, at dette enzym nedbryder det totale RNA.

mRNA-ekstraktion: Det er almindeligt at anvende et kit til at isolere mRNA'er, da hjemmelavede laboratorieprotokoller ikke genererer store mængder højtrenede mRNA'er. Kommercielle kits omfatter Invitrogen's FastTrack 2.0 eller Ambion's Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Disse grundlæggende trin er almindelige for sådanne kits:

a) Bland den RNase-hæmmede lysisbuffer, der leveres i kittet, med op til 300 μl total RNA.

b) Varm i 5 minutter ved 65 grader celsius og derefter afkøle prøven straks på is i et minut.

c) Bland dette med 0,5 M natriumchlorid og opløs fuldstændigt Oligo dT (oligodeoxythymidylsyre) i denne prøve.

d) Centrifuger denne prøve og genvinder supernatanten, som vaskes flere gange i en række bindings- og lavsaltbuffere i kittene.

e) Eliminer mRNA flere gange indtil et kitspecificeret volumen (fx 500 mikroliter) opnås.

f) Præcipiter eluatet med natriumacetat og ethanoludfældning. Re-suspenderes i op til 20 mikroliter af diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandlet vand.

g) Opbevar ved -80 grader Celsius og kontroller for kvalitet og mængde ved spektrofotometri.

Tip

Hold alle reagenser, celler og RNA kold ved at nedsænke i is. Dette forhindrer RNA i at blive forringet af andre enzymer, der frigives under homogeniseringsprocessen.

Advarsel

Reagenser som TRIzol er giftige og må ikke komme i kontakt med hud eller slimhinder. Overhold altid sikre laboratorieprotokoller ved håndtering af dette reagens.