Forskere udvikler etiketfri teknik til at afbilde mikrotubuli

Billeddannelse af meget små materialer kræver ikke kun stor dygtighed af mikroskopisten, men også gode instrumenter og teknikker. For et raffineret mikroskopisk kig på biologiske materialer, udfordringerne omfatter at få et billede, der er fri for "støj, " den interferens, der kan være forårsaget af en række genstande, inklusive området omkring en vare. Etiketter, farvestoffer, eller pletter, der tilføjes for at se emnet mere tydeligt, kan også give problemer, da de kan påvirke det emne, der skal scannes, på uventede måder - beskadige eller endda dræbe biologiske materialer.

At se på mikrotubuli er et interessant eksempel. Den hule rørformede struktur tjener som en rygrad i celler og hjælper med at transportere materialer i cellen. Defekte mikrotubuli er blevet forbundet med forskellige sygdomme, herunder kræft og Alzheimers sygdom.

At forstå, hvordan mikrotubuli fungerer, kan være et vigtigt skridt i forståelsen af ​​sygdomsprogression. Imidlertid, studere en enkelt dynamisk mikrotubuli, som måler 24 nanometer i diameter, og op til 10 mikrometer i længden, er ikke en nem opgave.

Forskere i Quantitative Light Imaging Laboratory ved Beckman Institute for Advanced Science and Technology ved University of Illinois har været i stand til at bruge mærkefri rumlig lysinterferensmikroskopi (SLIM) og computerbehandling for at afbilde mikrotubulierne i et assay. Studiet, "Mærkefri billeddannelse af enkelt mikrotubulus dynamik ved hjælp af rumlig lysinterferensmikroskopi, " blev for nylig offentliggjort i ACS Nano .

At kunne se mikrotubulierne uden brug af farvestoffer eller pletter er et stort bidrag.

"Det etiketfrie aspekt er efter min mening det vigtigste gennembrud, sagde Gabriel Popescu, lektor i el- og computerteknik, og medlem af Beckman's Bioimaging Science and Technology Group. Popescu er ledende forfatter på undersøgelsen.

"Der har været andre bestræbelser på at gøre denne etiketfri, det er en meget vigtig klasse af udfordringer. Nuværende teknikker giver mindre synsfelter, og billedkontrasten er ikke så god."

Ved at måle, hvor meget lys der forsinkes gennem prøven på alle punkter i synsfeltet, forskerne er i stand til at finde det optiske vejlængdekort for prøven. Denne optiske vejlængde - eller faseinformation - relaterer sig til en prøves brydningsindeks og tykkelse, muliggør detaljerede undersøgelser af cellestruktur og dynamik.

"Instrumentet giver en sløring af billedet, der er meget større end størrelsen af ​​mikrotubuli, " forklarer Popescu. "Så det er, som om det smører værdierne af den faseforsinkelse ud. Men da vi vores system meget godt, vi er i stand til at sikkerhedskopiere det og komme med en effektiv indeksværdi for mikrotubuli, hvilken er korrekt."

Den anvendte numeriske behandling giver følsomheden ikke kun til at se tubuli, men bruges også til at måle lysspredning.

"Et centralt fysikpunkt er, at når du kender både intensiteten og fasen af ​​lyset, så kan du numerisk behandle den information og praktisk talt udbrede lyset overalt i rummet, inklusive i et fly langt væk fra mikrotubuli, for at studere det spredte lys, sagde Popescu.

Tidligere bestræbelser på at afbilde de minimale strukturer har brugt immunfluorescens, at injicere antistoffer i fluorescerende farvestoffer for tydeligt at se cellen, som den fungerer. Imidlertid, fluorescensen kan påvirke cellefunktionen og den tid, cellen kan afbildes.

"Vi fotograferede dem i en meget lang periode, ikke to eller tre minutter, men mere som otte timer, sagde Mikhail Kandel, en doktorand i el- og computerteknik og hovedforfatter på studiet. "Folk er interesseret i metaboliske hastigheder af de proteiner, der går på mikrotubulierne, og vi viste, hvordan du kan se decelerationen af ​​disse proteiner, hvilket svarer til at overvåge forbruget af deres brændstofkilde."

"Du kunne potentielt finde ud af forbruget af ATP og proteinernes motilitetskarakteristika, som er meget interessante."

Beckman-forskerne arbejdede sammen med Paul Selvin, professor i fysik.

"Dette kom lige ud af en diskussion med Paul Selvins gruppe, som har studeret mikrotubuli i lang tid ved hjælp af traditionelle metoder til fluorescens, " sagde Popescu. "Mikhail kom i kontakt med sine elever, og de sagde, lad os give det en chance. At se dem med andre typer fluorescens er en stor forbedring, fordi du dybest set kan afbilde dem for evigt."

"Min gruppe er interesseret i at se, hvordan proteiner bevæger sig på og omkring mikrotubuli, " sagde Selvin, en af ​​undersøgelsens forfattere. "Denne nye teknik gør os ikke kun i stand til at få en idé om, hvordan cellerne vil fungere over tid, men øger også muligheden for in vivo billeddannelse af celler."

SLIM er et kommercielt fremstillet produkt, der kan passe til opgradering af ethvert mikroskop, siger forskerne. Dette giver biologer mulighed for at bruge andre mikroskopiteknikker, inklusive fluorescens, ud over SLIM. SLIM-produktet er tilgængeligt gennem Phi Optics, et firma, som Popescu grundlagde.

"En af de største udfordringer inden for interferometri er følsomhed, som er drastisk påvirket af miljøstøj, for eksempel, vibrationer eller luftudsving. Men med den særlige stabile geometri, der bruges i SLIM, vi kan faktisk opnå en utrolig følsomhed i brøkdele af nanometer, sagde Popescu.

Forskerne planlægger at skubbe grænserne for billeddannelsesceller, forhåbentlig billeddannelse af mikrotubuli i levende celler.

"Hvis det lykkes os at skubbe dette i en levende celle, det ville være et rigtigt gennembrud, " sagde Popescu. "Vi forventer store udfordringer på grund af den baggrund, der findes i cellerne. Opmuntret af disse resultater, vi tænker på, at vi en dag måske vil være i stand til at have sådan en følsomhed til at se faseskift fra enkelte molekyler.

"Vi er der ikke endnu, men man kan drømme."