Ny tilgang mere end fordobler stamcelleredigeringseffektiviteten, rapporterer forskere

Et Penn State-ledet hold af tværfaglige forskere har udviklet teknikker til at forbedre effektiviteten af ​​CRISPR-Cas9, genomredigeringsteknikken, der vandt Nobelprisen i 2020. Mens CRISPR-Cas9 er hurtigere, billigere og mere præcis end anden genredigering metoder, ifølge projektleder Xiaojun "Lance" Lian, lektor i biomedicinsk teknik og biologi ved Penn State, har teknologien begrænsninger - især i applikationer til at forbedre menneskers sundhed.

Forskerne udviklede en mere effektiv og tilgængelig proces til at anvende CRISPR-Cas9-systemer i humane pluripotente stamceller (hPSC'er), afledt af føderalt godkendte stamcellelinjer, som Lian sagde i høj grad kunne fremme diagnostik og behandling af genetiske lidelser. Metoden blev offentliggjort 7. september i Cell Reports Methods .

CRISPR-Cas9, som står for clustered regular interspaced short palindromic repeats og CRISPR-associated protein 9, giver forskere muligheden for at målrette præcise placeringer af genetisk kode for at ændre DNA, hvilket giver muligheder for at skabe nye diagnostiske værktøjer og potentielt korrigere mutationer til behandling af genetiske årsager af sygdom.

"Det menneskelige genom er enormt, og CRISPR-Cas9 gør det muligt for forskere at finde og målrette mod et muteret gen med det formål at studere det," sagde Lian.

CRISPR bruger en disk af genetisk materiale, kendt som plasmid-DNA, til at levere guidet ribonukleinsyre (RNA), der placerer Cas9-enzymet på den præcise placering af målgenet. Når DNA'et er lokaliseret, binder Cas9 sig til det og skærer det ud, så andet DNA kan reparere snittet. Forskere kan så se, hvordan fjernelsen ændrer genets udtryk. Men der er leverings- og redigeringseffektivitetsproblemer med de nuværende DNA-baserede CRISPR-metoder, ifølge Lian.

"Levering af DNA CRISPR effektorer er lav," sagde han. "Kun 20% til 30% af de målrettede celler vil modtage genredigerende DNA, når de bruger CRISPR. Levering af RNA til celler kan være mere effektiv, men når almindeligt RNA introduceres, kan cellerne se det som en virus. De ødelægger RNA, før det kan lave proteiner - for eksempel i løbet af et par timer - og dermed ødelægge genredigeringsforsøget."

For at forbedre resultatet ændrede forskerne måden, hvorpå genomredigeringsværktøjerne leveres til stamcellerne ved hjælp af modificeret RNA (modRNA). ModRNA'et adskiller sig fra plasmid-DNA ved, at det erstatter et af basissubstraterne, der findes i RNA, med en kemisk modificeret version, og det stabiliseres af stærkere strukturel støtte.

"ModRNA'et viste sig at være betydeligt mere effektivt end plasmid-DNA," sagde Lian. "Omkring 90 % af cellerne modtog modRNA'et fra en simpel transfektion, så det var i stand til at forblive på plads og udføre sit arbejde."

Forskerne fandt også ud af, at den tid, modRNA'et var på plads, var ideel:lang nok til at modificere cellerne, men ikke så lang, at det forårsagede aktivitet uden for målet. Men modRNA introducerede et andet problem, ifølge Lian.

Når modRNA Cas9 med succes leveres til målgenet, skaber det et dobbeltstrenget brud i genomet, som nogle celler vil forsøge at fikse. Dem, der fikser sig selv, kan videregive reparationen eller "mutationen" til deres afkom. Det er den proces, forskerne ønsker at forstå bedre, så det er de celler, de ønsker at høste og studere. Problemet, sagde Lian, er, at de fleste celler med denne pause identificerer det som et stort problem med genomet og vil selvdestruere i stedet for at forsøge at reparere sig selv.

For at reducere de giftige bivirkninger af Cas9 og hjælpe redigerede celler med at overleve, introducerede Lians team et lille protein, der er kendt for at hjælpe celler med at vokse. Ifølge Lian hæmmede dette tilføjede protein celledød og forbedrede Cas9-redigeringseffektiviteten op til 84 %.

Forskerne fandt også ud af, at modRNA'et kunne forbedre andre genredigeringsteknikker, såsom baseredigering. Basisredigering kan slå gener ud eller korrigere mutationer i genomet ved at bruge et protein til at ændre et enkelt nukleotid i stedet for at skære begge strenge, som CRISPR gør.

"Vi transficerede stamceller med enten et plasmidbaseret eller et modRNA-baseret baseredigeringsprotein," sagde Lian. "Vores modRNA-baserede metode var mere end fire gange mere effektiv, med 68 %, end den plasmidbaserede teknik, med omkring 16 %, til at redigere genomet med succes."

Ifølge Lian, efterhånden som flere genredigeringslaboratorier forbedrer genredigeringseffektiviteten og effektiviteten, vil forskere hurtigere kunne forstå gener og deres funktioner.

"Den menneskelige krop har mere end 20.000 gener, men alligevel studerer vi funktionerne af kun omkring 10% af dem," sagde Lian. "At undersøge formålet med hvert tilbageværende gen, et ad gangen, kan tage livet af sig. Brug af konstruerede stamceller fra vores højeffektive genredigeringsteknikker kan i høj grad fremskynde denne proces." + Udforsk yderligere

At studere sygdomme med bedre levering af genredigeringsværktøjer