Isolering af genomisk DNA fra jordnøddeblade?

Isolering af genomisk DNA fra jordnøddeblade:En trin-for-trin-guide

Denne protokol skitserer en grundlæggende metode til ekstraktion af genomisk DNA fra jordnøddeblade ved hjælp af en enkel og omkostningseffektiv tilgang.

Materialer:

* Jordnødder (frisk eller frosset)

* Flydende nitrogen

* Mørtel og stød

* 1,5 ml mikrocentrifuge rør

* 100 mm Tris-HCI (pH 8,0)

* 25 mm EDTA (ph 8,0)

* 1,4 M NaCl

* 10% SDS (natriumdodecylsulfat)

* Chloroform:Isoamylalkohol (24:1)

* Isopropanol

* 70% ethanol

* Rnase en opløsning (10 mg/ml)

* Spektrofotometer

Procedure:

1. prøveforberedelse:

* Saml friske eller frosne jordnøddeblade. Hvis du bruger frosne blade, skal du tø dem ved stuetemperatur.

* Vej ca. 0,1-0,2 g bladvæv.

* Placer bladene i en forkølet mørtel, og slib dem til et fint pulver ved hjælp af flydende nitrogen.

2. lysering:

* Overfør de pulveriserede blade til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.

* Tilsæt 500 µl lysebuffer (100 mM Tris-HCI, pH 8,0, 25 mM EDTA, pH 8,0, 1,4 M NaCI og 10% SDS).

* Inkuber røret ved 65 ° C i 30 minutter med lejlighedsvis blid rystelse. Dette trin nedbryder cellevæggene og membranerne og frigiver DNA'et.

3. Proteinfjernelse:

* Tilsæt 200 µl chloroform:isoamylalkohol (24:1) til røret.

* Ryst røret kraftigt i 10 minutter.

* Centrifuger røret ved 10.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Dette trin adskiller opløsningen i tre lag:vandigt lag (øverst), interfase (midt) og organisk lag (bund). DNA'et er i det vandige lag.

4. DNA -nedbør:

* Overfør forsigtigt det vandige lag til en ny 1,5 ml mikrocentrifuge -rør.

* Tilsæt 0,5 volumen isopropanol til røret og bland forsigtigt. Dette vil udfælde DNA'et ud af opløsningen.

* Inkuber røret ved -20 ° C i 30 minutter.

* Centrifuger røret ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C. DNA -pelleten dannes i bunden af ​​røret.

5. vask og tørring:

* Fjern supernatanten, og vask DNA -pelleten med 500 µl 70% ethanol.

* Centrifuger røret ved 10.000 x g i 5 minutter ved 4 ° C.

* Fjern ethanolen og lufttør pelleten i 5-10 minutter.

6. resuspension og RNase -behandling:

* Resuspender DNA-pelleten i 50 ul TE-puffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0).

* Tilsæt 1 µl RNase en opløsning (10 mg/ml) til røret.

* Inkuber røret ved 37 ° C i 30 minutter for at fjerne ethvert resterende RNA.

7. DNA -kvantificering og kvalitetskontrol:

* Kvantificer det ekstraherede DNA ved anvendelse af et spektrofotometer ved 260 nm og 280 nm bølgelængder. Forholdet mellem absorbans ved 260 nm/280 nm skal være mellem 1,8 og 2,0, hvilket indikerer rent DNA.

Bemærkninger:

* Denne protokol er en grundlæggende retningslinje og kan muligvis tilpasses baseret på det specifikke bladmateriale og den ønskede kvalitet af DNA'et.

* Brug altid handsker og laboratoriefrakker, når du håndterer biologiske prøver.

* Sørg for, at alle reagenser og udstyr er sterile for at undgå forurening.

* Du kan også bruge kommercielle DNA -ekstraktionssæt til en mere strømlinet og effektiv proces.

Yderligere applikationer:

* Det isolerede genomiske DNA kan bruges til forskellige molekylære biologiske applikationer, herunder:

* PCR (polymerasekædereaktion)

* DNA -sekventering

* Genetisk analyse

* Kloning

Denne protokol tilvejebringer en enkel og omkostningseffektiv metode til isolering af genomisk DNA fra jordnøddeblade og baner vejen for forskellige forskning og anvendelser.