En praktisk guide til design af PCR-primere

Af Sarah Quinlan
Opdateret 30. august 2022

Ifølge University of Wisconsin's BioWeb er en PCR-primer et kort, syntetisk oligonukleotid - typisk 18 til 25 nukleotider langt - der bruges til at amplificere specifikke DNA-segmenter via polymerasekædereaktion (PCR). Både fremadgående og omvendte primere, designet som omvendte komplementer, flankerer målregionen for at lette amplifikation. Når forskere målretter mod et specifikt gen eller DNA-område, genererer PCR tilstrækkeligt materiale til downstream-analyser. Hvis egnede primere ikke er tilgængelige fra publiceret litteratur eller kommercielle kilder, bliver det vigtigt at designe tilpassede primere.

Trin 1

Begynd med at hente nukleotidsekvensen af dit målgen eller DNA-region, og bestem længden af det fragment, du ønsker at amplificere. Konventionel PCR amplificerer fragmenter mellem 100 og 1.000 basepar, hvorimod real-time PCR typisk er målrettet mod 50 til 200 basepar.

Trin 2

Bestem, hvor i sekvensen dine primere vil binde – nær 5′- eller 3′-enden, i midten eller spænder over en intron, hvis det ønskes.

Trin 3

Overhold etablerede retningslinjer for primer-design; succesen med amplifikation afhænger af primerens kvalitet og nøgleparametre.

Trin 4

Design primere 18-24 nukleotider lange. Dr. Vincent R. Prezioso, Ph.D., fra Brinkmann Instruments anbefaler dette område for optimal specificitet og effektiv udglødning. Mål en smeltetemperatur (Tm) på 55–80°C, et GC-indhold på 40–60 % og en GC-klemme i 3′-enden. Undgå tre eller flere G/C-baser i de sidste fem positioner for at reducere uspecifik binding.

Trin 5

Undgå kørsler af fire eller flere identiske nukleotider eller dinukleotidgentagelser, da disse kan føre til fejlpriming. Sørg for ingen intra-primer- eller inter-primer-komplementaritet, der kunne danne selv-dimerer eller primer-dimerer.

Trin 6

Brug anerkendte onlineværktøjer – MITs Primer3 , NCBIs Primer-Blast , og IDT's OligoAnalyzer —for at evaluere primers egenskaber og forudsige sekundære strukturer.

Ting påkrævet

• Nukleotidsekvens for mål-DNA-regionen
• Primer-designsoftware eller websted