Professionel guide til isolering af mRNA fra celler

Af Palmer Owyoung
Opdateret 30. august 2022

Jupiterimages/Photos.com/Getty Images

Den genetiske kode for en celle ligger i dens DNA, som forbliver låst i kernen. For at studere genekspression eller for at generere komplementære DNA (cDNA) biblioteker, skal DNA'et først transskriberes til messenger RNA (mRNA). Isolering af mRNA af høj kvalitet er afgørende for at detektere sjældne transkripter, designe mikroarray-prober og konstruere cDNA-biblioteker.

Isolering af mRNA fra totalt RNA

Trin 1 – TRIzol-homogenisering

Begynd med at resuspendere pelleterede celler i TRIzol Reagent (Life Technologies) eller en tilsvarende phenol-guanidinopløsning, såsom Ambions TRI Reagent. Dette reagens lyserer samtidigt celler, denaturerer proteiner og beskytter RNA mod enzymatisk nedbrydning.

Trin 2 – Total RNA-isolering

Udfør en række centrifugeringer for at adskille cellulære komponenter i forskellige faser. Kassér det gule, fedtrige øverste lag. Saml den røde vandige fase, som indeholder den komplette RNA-population (mRNA, tRNA, rRNA og ikke-kodende RNA'er). Følg phenol-chloroform-ekstraktionsprotokollen, og vask derefter RNA-pelleten med isopropanol og ethanol. Tilføj RNase-hæmmere hele vejen igennem for at bevare RNA-integriteten.

Trin 3 – mRNA-ekstraktion

Kommercielle kits giver den mest reproducerbare mRNA-oprensning. Populære valg omfatter Invitrogens FastTrack 2.0 og Ambions Poly(A)Pure mRNA Isolation Kit. En typisk kitprotokol forløber som følger:

• Kombiner op til 300 µL total RNA med sættets RNase-hæmmede lysisbuffer.
• Opvarm ved 65°C i 5 minutter, og afkøl derefter på is.
• Tilsæt 0,5 M NaCl og opløs den medfølgende oligo-dT (oligodeoxythymidylsyre) i blandingen.
• Centrifuger og genvind supernatanten; binde mRNA'et til den medfølgende silicamatrix.
• Vask gentagne gange med buffer med lavt saltindhold og derefter med vaskebuffer.
• Eluere mRNA'et til det specificerede volumen (typisk ~500µL).
• Fæld eluatet ud med natriumacetat og ethanol, og resuspender derefter i 10-20µL DEPC-behandlet vand.
• Opbevares ved –80°C og vurder koncentration og renhed ved hjælp af et UV-spektrofotometer.

Ting påkrævet

• Laminær flow kabinet
• Personligt beskyttelsesudstyr (laboratoriefrakke, handsker, øjenbeskyttelse)
• Pipetter, spidser, beholdere til bortskaffelse af biologiske farer
• Højhastighedscentrifuge, varmeblok
• RNA-frie bænkeoverflader
• RNAzap- eller RNAoff-reagenser
• Kommercielle mRNA-ekstraktionssæt (Invitrogen, Ambion osv.)
• Natriumacetat, ethanol, isopropanol
• DEPC-behandlet vand
• UV-spektrofotometer og forbrugsstoffer
• Celler egnede til RNA-ekstraktion
• TRIzol eller TRI-reagens
• RNase-hæmmere

TL;DR

Hold alle reagenser, celler og ekstraheret RNA kolde ved at placere dem på is. Kolde forhold hæmmer RNase-aktivitet frigivet under homogenisering.

Advarsel

TRIzol og lignende phenol-guanidinreagenser er giftige. Undgå kontakt med hud og slimhinder, og overhold strengt de institutionelle sikkerhedsprotokoller.

Referencer

• "cDNA-biblioteksprotokoller"; Ian G. Cowell og Caroline A. Austin, 1997
• "In vitro-transskriptions- og oversættelsesprotokoller"; Martin J. Tymms, 1995