Superopløselig mikroskopi i både rum og tid

Superopløselig mikroskopi er en teknik, der kan "se" ud over lysets diffraktion, giver enestående udsigt over celler og deres indre strukturer og organeller. Teknikken har vundet stigende interesse for nylig, især siden udviklerne vandt Nobelprisen i kemi i 2014.

Men mikroopløsning med superopløsning har en stor begrænsning:den tilbyder kun rumlig opløsning. Det kan være tilstrækkeligt for statiske prøver, som faste materialer eller faste celler, men når det kommer til biologi, tingene bliver mere komplicerede. Levende celler er meget dynamiske og afhænger af et komplekst sæt af biologiske processer, der forekommer på tværs af sekundære tidsskalaer, konstant skiftende. Så hvis vi skal visualisere og forstå, hvordan levende celler fungerer i sundhed og sygdom, vi har også brug for en høj tids (eller "tidsmæssig") opløsning.

Et team ledet af professor Theo Lasser, lederen af ​​Laboratory of Biomedical Optics (LOB) på EPFL har nu gjort fremskridt med at løse problemet ved at udvikle en teknik, der kan udføre både 3D-superopløselig mikroskopi og hurtig 3D-fasebilleddannelse i et enkelt instrument. Fasebilleddannelse er en teknik, der oversætter ændringerne i lysfasen forårsaget af celler og deres organeller til brydningsindeks -kort over cellerne selv.

Den unikke platform, som kaldes et 4-D mikroskop, kombinerer følsomhed og høj tidsopløsning af fasebilleddannelse med specificiteten og høj rumlig opløsning af fluorescensmikroskopi. Forskerne udviklede en ny algoritme, der kan gendanne faseinformationen fra en stak lysfeltbilleder taget af et klassisk mikroskop.

"Med denne algoritme, vi præsenterer en ny måde at opnå 3-D kvantitativ fasemikroskopi ved hjælp af et konventionelt lysfeltmikroskop, "siger Adrien Descloux, en af ​​hovedforfatterne til papiret. "Dette tillader direkte visualisering og analyse af subcellulære strukturer i levende celler uden mærkning."

For at opnå hurtig 3D-billeddannelse, forskerne specialdesignede et billeddelt prisme, som tillader samtidig optagelse af en stak med otte z-forskudte billeder. Dette betyder, at mikroskopet kan udføre højhastigheds 3D-fasebilleddannelse på tværs af et volumen på 2,5μm x 50μm x 50μm. Mikroskopets hastighed er dybest set begrænset af kameraets hastighed; til denne demonstration, holdet var i stand til at forestille sig intracellulær dynamik ved op til 200 Hz. "Med prismen som en tilføjelse, du kan forvandle et klassisk mikroskop til en ultrahurtig 3-D-billedkamera, "siger Kristin Grussmayer, en anden af ​​papirets hovedforfattere.

Prismen er også velegnet til 3D-fluorescensbilleddannelse, som forskerne testede ved hjælp af superopløselig optisk fluktuationsbilleddannelse (SOFI). Denne metode udnytter blinkende fluorescerende farvestoffer til at forbedre 3D-opløsning gennem korrelationsanalyse af signalet. Ved hjælp af dette, forskerne udførte 3D-superopløsningsbilleddannelse af farvede strukturer i cellerne, og kombinerede det med 3-D mærkefri billeddannelse. De to teknikker supplerede hinanden meget godt, afslørende fascinerende billeder af den indre arkitektur, cytoskelet, og organeller også i levende celler på tværs af forskellige tidspunkter.

"Vi er begejstrede over disse resultater og mulighederne ved denne teknik, "siger professor Hilal Lashuel, hvis laboratorium på EPFL gik sammen med professor Lasser om at bruge den nye teknik til at studere de mekanismer, hvormed proteinaggregering bidrager til udvikling og progression af neurodegenerative sygdomme, såsom Parkinsons og Alzheimers. "De tekniske fremskridt muliggjorde højopløselig visualisering af dannelsen af ​​patologiske alfa-synuclein-aggregater i hippocampusneuroner."

Teamet har navngivet den nye mikroskopi -platform PRISM, til fasehentningsinstrument med superopløselig mikroskopi. "Vi tilbyder PRISM som et nyt mikroskopi-værktøj og forventer, at det hurtigt vil blive brugt i life science-samfundet til at udvide mulighederne for 3D-højhastighedsbilleddannelse til biologiske undersøgelser, "siger Theo Lasser." Vi håber, at det bliver en almindelig arbejdshest for neurovidenskab og biologi. "