Fluorescensmikroskopi får BAMM -behandlingen

En ny teknik udviklet af forskere ved ARC Center of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CNBP) vil hjælpe med at skinne nyt lys på biologiske spørgsmål ved at forbedre kvaliteten og mængden af ​​information, der kan udvindes i fluorescensmikroskopi.

Teknikken, 'blegningsassisteret flerkanalsmikroskopi' (BAMM) tager en nuværende langvarig svaghed ved fluorescensmikroskopi-fotoblegning-og forvandler den til en styrke, der forbedrer billeddannelse med op til tre gange, uden yderligere hardware påkrævet.

Rapporteret i journalen Biomedicinsk optik Express , BAMM vil hjælpe forskere med at få biologisk indsigt i de indviklede processer, der finder sted i levende celler. Dette inkluderer samspillet mellem proteiner og molekyler, der har potentiale til at påvirke en lang række sundhedsområder fra fertiliteten, til smerter, til hjertesygdomme og meget mere.

"Fluorescensmikroskopi er en af ​​de mest anvendte teknikker inden for biologi. Det er her lysemitterende molekyler kaldet fluoroforer er bundet til ekstremt små cellulære mål såsom proteiner, genetisk materiale eller andre biomolekyler af interesse, "siger Dr. Antony Orth, CNBP Research Fellow ved RMIT University og hovedforfatter af forskningspapiret.

"Når fluoroforen exciteres af lys fra mikroskopet, den reagerer ved at udsende en bestemt farvesignatur. At se den farvesignatur under mikroskopet hjælper os med at se, spore og forstå det cellulære mål, som fluoroforen har været bundet til. "

Især siger Dr. Orth, du kan vedhæfte forskellige farvede fluoroforer til forskellige cellemål, alt i én prøve, for at maksimere de data og billedinformationer, der modtages.

Denne traditionelle tilgang til fluorescensmikroskopi er alsidig, men der er en stor begrænsning:det synlige (eller farve) spektrum, hvor de fleste fluoroforer opererer, kan blive overfyldt. I et ideelt eksperiment, hvert mål skal vælges for at have en tydelig farveemission, men dette bliver stadig vanskeligere at arrangere, da antallet af mål stiger.

"Det synlige farvespektrum spænder over et område på 400 nanometer (nm) til 700 nm, og kun ca. 200 nm af dette område er tilgængeligt til fluorescensfarveemission, "forklarer Dr. Orth.

"En typisk fluorofor udsender over et 50 nm område af farvespektret. Opdeling af 200 nm af det synlige spektrum i 50 nm segmenter betyder, at farverne på de fluorescerende emittere begynder at blande sig, når du forsøger at presse mere end fire farver ind."

"Dette begrænser generelt forskere til fire eller færre fluorescerende mål i en prøve, "siger Dr. Orth.

"Typisk, de fleste eksperimenter er endnu mindre ambitiøse, kun inkorporere to eller tre mål. Kernen i problemet er, at kun en egenskab af fluoroforen - dens farve - bruges til identifikation. "

For at hjælpe med at overvinde denne begrænsning, Dr. Orth og hans medforskere har udviklet en innovativ teknik kaldet 'blegningsassisteret multikanalmikroskopi' (BAMM) for at øge deres billeddannelse.

"I stedet for at bruge farve til at skelne mellem fluoroforer, vi bruger tidens fjerde dimension og udnytter et fænomen kaldet fotoblegning - dæmpning af en samling fluoroforer eller pigmenter under gentagen eksponering for lys, "siger Dr. Orth.

"Fordi hver type fluoroforfotoblegemiddel i en anden hastighed, vi kan skelne mellem fluoroforer uden at bruge farveoplysninger. Vi bruger fotoblegningshastigheden som identifikator. "

"Når det er parret med traditionel farveinformation, denne ekstra dimension af fotoblegning gør det muligt for forskere at bruge 2-3 gange flere typer fluorescerende molekyler, alt i en prøve. Dette lader os udtrække langt flere oplysninger fra en enkelt undersøgelse. "

"Forskere vil kunne designe mere informative tests - f.eks. fremhæve fem mål, da kun to tidligere var praktiske. De skal ikke længere undgå at bruge to fluoroforer med samme farve, da en forskel i fotostabilitet alene er nok til at skelne mellem de to mål, " han siger.

Traditionelt set fænomenet fotoblegning (eller falmning) har været skadeligt for den fluorescerende mikroskopiproces. Det er her, hvor høj intensitet og vedvarende belysning fra mikroskopet permanent ødelægger en fluorofors evne til at fluorescere, så billeddannelse af cellemålet bliver umuligt.

"BAMM forvandler fotoblegning fra en langvarig svaghed ved fluorescensmikroskopi til en betydelig styrke for at muliggøre øget identifikation af cellulære mål, " siger Dr. Orth.

"BAMM kræver ikke yderligere hardware, det er forholdsvis enkelt at gøre og kræver ikke specialiseret prøveforberedelse. Det er en ekstremt spændende ny tilgang, som har potentialet til at gavne alle brugere af fluorescensmikroskopi og deres udforskende videnskab, " han siger.

Forskere, der formelt var involveret i BAMM -projektet, var tilknyttet CNBP (RMIT University og University of Adelaide) og Thermo Fisher Scientific.