Ny metode giver mikroskop et boost i opløsning

Forskere ved universitetet i Würzburg har været i stand til at øge den nuværende superopløsningsmikroskopi med en ny tweak. De belagte glasdækslet som en del af prøvebæreren med skræddersyede biokompatible nanosheets, der skaber en spejleffekt. Denne metode viser, at lokalisering af enkeltemittere foran en metal-dielektrisk belægning fører til højere præcision, lysstyrke og kontrast i Single Molecule Localization Microscopy (SMLM). Undersøgelsen blev offentliggjort i Natur tidsskrift Lys:Videnskab og applikationer .

Skarpheden i et lysmikroskop er begrænset af fysiske forhold - strukturer, der er tættere på hinanden end 0,2 tusindedele af en millimeter sløring, og kan ikke længere skelnes fra hinanden. Årsagen til denne sløring er diffraktion. Hvert punktformet objekt vises derfor ikke som et punkt, men som et sløret sted.

Med matematiske metoder, opløsningen kan stadig forbedres drastisk. En metode ville beregne dens nøjagtige center ud fra lysstyrkefordelingen af ​​det slørede sted. Imidlertid, det virker kun, hvis to tæt tilgrænsende punkter i objektet i første omgang ikke er samtidigt, men efterfølgende synlige, og fusioneres senere i billedbehandlingen. Denne tidsmæssige afkobling forhindrer overlejring af det slørede sted. Årevis, forskere inden for biovidenskab har brugt denne vanskelige metode til superhøj opløsning lysmikroskopi af celler.

En sådan metode blev udviklet af forskergruppen hos Prof. Dr. Markus Sauer ved Würzburg University:direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM). Denne kraftfulde SMLM -teknik kan levere en lateral opløsning på ~ 20 nm. Til dette formål, visse strukturer, for eksempel, porer i en cellekerne, er farvet med fluorescerende farvestoffer. Hvert af farvestofmolekylerne blinker med uregelmæssige intervaller og repræsenterer en del af poren. Billedet af atomporerne er derfor ikke i første omgang synligt, men opstår efter billedbehandlingen ved overlejring af flere tusinde billeder. Med dSTORM -teknikken, opløsningen af ​​et konventionelt lysmikroskop kan øges med en faktor 10. "Det giver os mulighed for at visualisere en celles arkitektur ned til dets molekylære niveau, for eksempel, "forklarer Hannah Heil. Forskeren doktorerer ved Rudolf Virchow Center ved universitetet i Würzburg i gruppen af ​​professor Katrin Heinze.

Imidlertid, fotonstatistikken definerer en virtuel opløsningsgrænse i opløsning. For at løse dette problem, Katrin Heinze havde ideen om at bruge relativt enkle biokompatible nanocoatings til at øge signalet. I en fælles indsats med Markus Sauer og kolleger fra det fysiske fakultet, Hannah Heil designet og fremstillede metal-dielektriske nanocoatings, der opfører sig som et afstemeligt spejl. Det fordobler næsten opløsningen.

Spejl, spejl på væggen:Hvilket billede er det skarpeste af dem alle?

Under observationen, de anbragte cellerne på et dampafsat dækglas med en tynd reflekterende nano-belægning bestående af sølv og transparent siliciumnitrit. Belægningen er biokompatibel, så det skader ikke cellen. Med denne metode, de to grupper opnåede to effekter:Spejlet reflekterede lyset, der udsendes til mikroskopet, hvilket øgede lysstyrken af ​​fluorescenssignalet og dermed også den effektive billedskarphed.

Sekund, de udsendte og de reflekterede lysbølger overlejres. Dette skaber såkaldt interferens. Afhængigt af afstanden til spejlet, lyset forstærkes eller dæmpes. "På denne måde, vi ser primært strukturer i et bestemt billedplan, "siger Heil." Alt, hvad der er over eller under og muligvis kan forstyrre billedet, er, på den anden side, skjult. "For at sikre, at de nøjagtige dele af billedet bliver synlige, tykkelsen af ​​det transparente lag, der påføres spejlet, skal vælges passende. Blandt andet, Heinze og Heil bruger computersimuleringer til at skræddersy belægningen efter objektet.

Samlet set, metoden er overraskende let at bruge, siger Hannah Heil. "Det er det, jeg virkelig kan lide ved vores tilgang." Professor Heinze tilføjer, "Bortset fra det billige metal-dielektriske belagte dækglas er der ikke behov for yderligere mikroskophardware eller -software for at øge lokaliseringspræcisionen, og dermed er en fantastisk tilføjelse til avanceret mikroskopi. "