Nanoskopisk proteinbevægelse på en levende cellemembran

Cellulære funktioner dikteres af den indviklede bevægelse af proteiner i membraner, der spænder over en skala fra nanometer til mikrometer, inden for en tidsramme på mikrosekunder til minutter. Imidlertid, denne rige parameter i rummet er utilgængelig ved hjælp af fluorescensmikroskopi, selvom det er inden for rækkevidde af interferometrisk spredning (iSCAT) partikelsporing. Den nye iSCAT -teknik er, imidlertid, meget følsom over for enkelte og umærkede proteiner, derved forårsager uspecifik baggrundsfarvning som en væsentlig udfordring under cellulær billeddannelse.

I en nylig undersøgelse, Richard W. Taylor og kolleger på de tværfaglige afdelinger for fysik og biologi i Tyskland udviklede en ny billedbehandlingstilgang for at overvinde denne vanskelighed. De brugte metoden til at spore den transmembrane epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) med nanometerskalapræcision i tre dimensioner (3-D). Teknikken tillod billeddannelse på tværs af mikrosekunder til minutter. Forskerne gav eksempler på bevægelse og indeslutning i nanoskala ved hjælp af metoden til at afbilde allestedsnærværende processer såsom diffusion i plasmamembraner, transport i filopodia og rotationsbevægelse under endocytose. Resultaterne er nu offentliggjort i Natur fotonik .

Mens støt fremgang i fluorescensmikroskopi har gjort det muligt for forskere at overvåge cellulære begivenheder i nanometerskala, der mangler stadig at blive opnået meget med avancerede billeddannelsessystemer. Udfordringerne ved fluorescensmikroskopi opstod på grund af den endelige emissionshastighed af en fluorescerende kilde (farvestofmolekyle eller halvlederkvanteprik), hvor for få fotonemissioner i løbet af en meget lille tidsramme forhindrede effektiv eller langvarig billeddannelse. Den centrale vanskelighed ved spredningsbaseret mikroskopi er i forhold til den nanoskopiske sonde, som konkurrerer mod baggrundsstøj og et lavt signal-til-støj-forhold (SNR); at begrænse billedbehandlingens potentiale til kun et par nanometer i eksperimenter med højhastighedssporing.

I nærværende arbejde, Taylor et al. brugte interferometrisk spredning (iSCAT) mikroskopi til at spore protein i levende cellemembraner. Metoden kunne visualisere sonde-celle-interaktioner for at forstå dynamikken mellem diffusion og lokal topologi. Under forsøgene, forskerne brugte guldnanopartikler (GNP'er) til at mærke epidermale vækstfaktorreceptorer (EGFR'er) i HeLa-celler. EGFR'erne er type I transmembrane proteiner, der kan føle og reagere på ekstracellulære signaler, hvis afvigende signalering er forbundet med en række sygdomme. Taylor et al. viste det BNP-mærkede protein som en 'nano-rover', der kortlagde nano-topologien af ​​cellulære funktioner såsom membranterrasser, filopodia og clathrin strukturer. De gav eksempler på subdiffusion og nanoskopisk indeslutningsbevægelse af et protein i 3D ved høj tidsopløsning og lange tidspunkter.

I forsøgene, Taylor et al. introducerede de epidermale vækstfaktor-guld nanopartikel (EGF-GNP)-prober til prøvekammeret i mikroskopet ved hjælp af en mikropipette til at mærke EGFR'erne (epidermal vækstfaktor-receptorer) på HeLa-celler og verificerede, at proberne stimulerede EGFR'erne. Tidligere undersøgelser havde allerede vist, at sondestørrelsen kunne påvirke lipiddiffusionen i syntetiske membraner, selvom de ikke påvirkede diffusionsmåden. Derudover i levende celler, molekylær crowding var ubetydelig for partikler lig med eller mindre end 50 nm.

Taylor et al. verificeret disse to konkrete tilfælde i dette arbejde ved at sammenligne BNP'er med varierende diametre ved 48 nm og 20 nm. Forskerne gennemførte derefter fluorescerende og biokemiske undersøgelser for at foreslå, at de EGF-belagte BNP aktiverede EGFR-signalering, meget gerne de frit tilgængelige EGF'er, hvilket indikerer, at mærket ikke hindrede biologiske funktioner. For at overvinde baggrundsstøj i forbindelse med molekylær billeddannelse implementerede forskerne en ny algoritme, som udtrak den fulde iSCAT-punktspredningsfunktion (iSCAT-PSF) direkte fra hver ramme for klarhed. Da eksisterende teknikker ikke er i stand til at visualisere funktioner ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning, mange detaljer om intracellulær aktivitet er stadig et spørgsmål om debat. Som svar, den nye metode af Taylor et al. tilbød et væld af dynamiske heterogeniteter i 3D for at kaste lys over intracellulær proteinbevægelse.

Forskerne undersøgte først kvantitativt subdiffusion i plasmamembranen ved at overveje et 2-D eksempel på EGFR-rejsen på membranen af ​​en levende HeLa-celle. For det, de beregnede den gennemsnitlige firkantforskydning (MSD) for hele bevægelsesbanen. Taylor et al. behøvede ikke at foretage antagelser om arten af ​​diffusion eller dets geografiske landskab under beregningen. De målte forekomsten af ​​biologiske diffraktive barrierer og indespærringer ved at observere graden af ​​retningskorrelation mellem to vektorielle trin på tværs af et tidsrum.

Forskerne vurderede derefter populariteten af ​​hver banepixel i rummet ved at introducere et akkumuleret temporal occupancy map (ATOM). I denne teknik, de inddelte banens laterale plan i nanometer-store bins og talte forekomsten af ​​partiklen i hver bin. Resultaterne indikerede arrangementet af nanostrukturer i sløjfer og hvirvler inden for en minimal levetid på 250 nanosekunder (5000 billeder) for potentielt at skildre et præ-endocytisk trin. I alt, de simulerede observationer viste, hvordan proteindiffusion blev påvirket af cellens understruktur.

ISCAT -mikroskopiteknikken tillod forskere at registrere effekter i en meget lang periode, som de brugte sammen med 3D-billeddannelsesfunktioner til at følge EGFR'er på et filopodium. Filopodia er biologisk stavlignende cellulære fremspring indeholdende bundter af aktinfilamenter med en diameter på op til 100 til 300 nm og en længde på 100 µm. Nanostrukturer kan fornemme mekaniske stimuli til kemoattraktion eller frastødning i det cellulære mikromiljø, samtidig med at de giver steder til celleadhæsion. Ligandbinding og EFGR -aktivering på filopodia forekom ved lave koncentrationer af EGF, efterfulgt af dets association med actinfilamenter og retrograd transport af EFGR til cellelegemet.

Forskerne fik således indsigt i de nanoskopiske detaljer ved diffusion langs filopodium og registrerede dataene over 13 minutter. De analyserede 3D-banen for at skabe filopodium-topografien ved hjælp af guldnanopartikler som en 'nano-rover' og kortlagde overfladetopologien af ​​cellulære strukturer til en dybere undersøgelse. De plottede banen ATOM (akkumuleret kort for tidsbelægning) og fandt ud af, at 3D-repræsentationen var i overensstemmelse med det biologiske trin med præ-endocytisk membraninvasion.

Højhastighedsmikroskopiteknikker såsom iSCAT er nødvendige for at opnå tidsoplysninger i høj opløsning og forhindre sløring af effekter under nanopartikellokaliseringsbaseret billeddannelse. Forskerne demonstrerede denne funktion ved at registrere begrænset diffusion ved 30, 000 fps (billeder pr. sekund) med 48 nm og 20 nm BNP'er. De fulgte eksperimenterne med ultrahøjhastigheds 3D-sporing af proteiner ved 66, 000 fps ved hjælp af en kort eksponeringstid på 10 µs inden for en tidsvarighed på 3,5 sekunder. Hurtig iSCAT-mikroskopi-billeddannelse gav yderligere bevis for at afsløre de indviklede træk ved endocytiske hændelser i forhold til clathrin-medieret endocytose i HeLa-celler, når de blev simuleret af lave koncentrationer af EGF.

På denne måde, Taylor et al. bemærkede, at den nye teknik trofast kunne registrere nano-topografiske oplysninger. Resultaterne matchede observationerne optaget med transmissionselektronmikroskopi (TEM) uden signifikante forskelle på probestørrelsesreduktion fra 48 nm til 20 nm, og samtidig give ny indsigt. Den nye indsigt omfattede detaljer om subdiffusion, nanoskopisk indespærring, 3-D konturer af filopodia og clathrin strukturer på nanoskala. Forskerne agter at kombinere iSCAT med in situ superopløselig fluorescensmikroskopi for at forstå proteinernes baner, vira og andre nanoskopiske biologiske enheder. Taylor et al. sigter mod at fremme metoderne til billedanalyse for at spore BNP mindre end 20 nm i fremtiden og tror på, at den nye teknologi og yderligere optimering vil give dem mulighed for specifikt at forstå virusses livscyklus uden at bruge en ekstern etiket til sporing.

© 2019 Science X Network