Ny metode fanger real-time bevægelse af millioner af molekyler i 3D

Den humane immundefektvirus, eller hiv, lønningskrig i vores kroppe ved hjælp af en strategi, der har udviklet sig over millioner af år, der vender vores egne mobiltelefoner mod sig selv. På trods af massive fremskridt med at forstå sygdommen, der er stadig vigtige huller. Årevis, forskere ved University of Utah ønskede, at der var en måde at visualisere, hvordan virussen og dens molekyler interagerer med menneskelige celler i realtid. Så, en forskergruppe udviklede en.

Den nye metode anvender interferometri til at fange ekstremt højopløsningsvisualiseringer af millioner af molekyler, der bevæger sig over viskøse geler eller en plasmamembran. Ipsita Saha, fysik doktorand og hovedforfatter af undersøgelsen, udviklede en korrelationsanalyse, der teoretisk forklarede, hvordan interferometri -mikroskopet kunne skelne mellem to typer bevægelser - flow og diffusion - og hun og seniorforfatter Saveez Saffarian verificerede det eksperimentelt. Metoden bringer os et skridt tættere på at visualisere, hvordan molekyler interagerer i en egentlig levende celle.

"Der er allerede metoder, der fanger, hvordan molekyler flyder og diffunderer i to dimensioner. Vi ville se, hvad der sker på tværs af hele mobilmiljøet. Hvordan fungerer disse molekyler? Hvilken slags interaktioner finder sted?" sagde Saha, som også er tilknyttet Center for Cell and Genome Science (CCGS) ved U.

"Indtil nu, vi er blevet overladt til bare at forestille os disse interaktioner. Vi har meget begrænsede måder at faktisk gå ind i cellen og observere, hvordan alle disse molekyler danser sammen på samme tid, "sagde seniorforfatter Saffarian, lektor i fysik, adjungeret adjunkt i biologi og tilknyttet CCGS. "Vi havde virkelig brug for at generere metoder med højere opløsning, der kan se på dynamikken i biologiske molekyler."

Undersøgelsen offentliggjort i tidsskriftet PLOS ONE den 18. december, 2019.

Flow og diffusion

Celler fungerer som et effektivt kontor. Proteiner og andre molekyler udfører opgaver, udvikle produkter, kommunikere med hinanden og bevæge sig rundt, selv forlader deres særlige celle for at vade ind i den store verden. Bevægelse er afgørende for, at molekyler kan finde og interagere med hinanden og deres omgivelser. Denne undersøgelse havde til formål at skelne mellem to typer bevægelser:flow og diffusion.

Molekyler flyder, når de har en bias mod at bevæge sig i en bestemt retning. Diffusion er, når molekyler bevæger sig tilfældigt rundt. For at forstå, hvordan celler eller vira fungerer, Det er vigtigt at forstå mekanikken i, hvordan de bevæger sig.

"Bærer disse molekyler forskellige ting fra et sted til et andet, eller foregår der andre processer? "sagde Saha." Denne metode kan specifikt skelne mellem flow og diffusion i tre dimensioner. "

Forskerne brugte et interferometri -mikroskop, som måler den afstand, lyset bevæger sig over nanoskalaer. Molekyler udsender fotoner, der bevæger sig som lysbølger, hver med specifikke amplituder og frekvenser. Til forsøget, mikroskopet opdelte en lysstråle i to stråler, der vandrede ad forskellige veje, til sidst vender tilbage for at møde hinanden. Disse bjælker kombineres i et prisme, og tre separate refleksioner af deres kombination er afbildet på tre kameraer. Interferensen er sådan, at hvis et molekyle bevæger sig 80 nanometer, billedet flyttes til et andet kamera. Dette er ekstremt høj opløsning - en menneskelig rød blodlegeme er omkring 7, 000 nanometer på tværs. Forskerne målte opløsningen i voxels, som er pixels i tre dimensioner.

Saha og Saffarian skabte en saccharosegel injiceret med kvantepunkter - menneskeskabte nanoskala -krystaller, der leder elektroner. Kvantepunkterne producerer et signal, som mikroskopet kan registrere. Ved først at lære, hvordan kvantepunkter bevæger sig i gelen, forskerne validerede deres teknik, som derefter kunne anvendes på, hvordan proteiner bevæger sig inde i en celle. De afkølede gelen til stuetemperatur for at bremse stoffet til en hastighed, som kameraerne kunne fange.

"Du kan faktisk se, om molekyler går i en bestemt retning, eller om de bevæger sig tilfældigt. Og du kan gøre dette i meget, meget små voxler på tværs af et stort tværsnit af prøven, som har et enormt væld af oplysninger, "sagde Saffarian. Forskerne brugte Center for High Performance Computing i U til at behandle de enorme mængder data.

Forskerne målte, hvor længe disse lysbølger "huskede" hinanden ved at beregne sandsynligheden for, hvor længe bølgerne ville beholde deres amplitude og frekvens, kaldes sammenhæng. Lys udsendt fra det samme molekyle vil dukke op i kameraerne med den samme sammenhæng. De brugte korrelationsfunktionen til at finde ud af, hvordan molekylerne bevægede sig og i hvilken retning. Hvis de opdelte lysstråler bevæger sig på separate stier mindre end 10 mikron væk fra hinanden, de husker, at de kom fra det samme molekyle. Når lysstrålerne mødes igen, de vil kombinere med den viden. Hvis de ikke kender hinanden, de har en 30% sandsynlighed for at dukke op i et af de tre kameraer. Hvis de husker hinanden, de har en 100% sandsynlighed for at dukke op i et kamera, men 0% sandsynlighed for at dukke op hos de andre. Denne metode måler lys, der udsendes fra millioner af molekyler på én gang, gør denne metode ideel til at studere flow og diffusion på tværs af celler og væv.

Forbedring af teknologien

Selvom denne metode registrerer bevægelse på tværs af viskøse geler eller plasmamembraner, det er ude af stand til at oprette et kort over partikler, der bevæger sig hen over en egentlig celle. Imidlertid, Saha og Saffarian samarbejder nu med forskere ved ThermoFisher Scientific (FEI) i Tyskland om at bygge en prototype af et mikroskop med meget hurtigere detektorer, der vil være i stand til at fange bevægelse inden for levende celler. De er en del af en patentansøgning om teknologien og vil analysere data fra eksperimenterne.

"Vi kan allerede bruge denne metode til langsomme processer, men i vores laboratorium, vi er biologer på et eller andet niveau. Vi vil virkelig forstå, hvordan biologi fungerer, og incitamentet bag al denne metodeudvikling er at forstå, hvad er den vanvittige dans af molekyler i celler og væv, der tillader virkelig eksotisk biologi at komme videre? At komme dertil, vi har brug for meget hurtigere detektorer, "Sagde Saffarian.