Udvikling af et digitalt holografi-baseret multimodalt billeddannelsessystem til at visualisere levende celler

En forskergruppe ledet af Kobe Universitets professor MATOBA Osamu (Organisation for Advanced and Integrated Research) har med succes skabt 3-D fluorescens og fasebilleddannelse af levende celler baseret på digital holografi. De brugte planteceller med fluorescerende proteinmarkører i deres kerner til at demonstrere dette billeddannelsessystem.

Gruppen bestod af projektadjunkt Manoj KUMAR og adjunkt Xiangyu QUAN (begge fra Graduate School of System Informatics), Professor AWATSUJI Yasuhiro (Kyoto Institute of Technology) og lektor TAMADA Yosuke (Utsunomiya University).

Denne teknologi vil danne grundlag for billeddannelse af levende celler, som er uundværlig inden for det life science område. Det forventes også, at brug af denne teknologi til at visualisere stamcelleprocesser i planter vil øge vores forståelse af dem.

Disse forskningsresultater blev offentliggjort i tidsskriftet Videnskabelige rapporter , udgivet af Springer Nature den 15. maj.

Forskningsbaggrund

Det optiske mikroskop blev opfundet i slutningen af ​​det sekstende århundrede, og den britiske videnskabsmand Robert Hooke var den første til at opdage celler i midten af ​​det syttende århundrede. Opfindelsen er blevet udviklet til nye teknologier såsom fasekontrastmikroskopet (1953 Nobelprisen i fysik), som gør det muligt at observere levende celler uden behov for at farve dem, og fluorescerende cellulær billeddannelse, hvor specifikke molekyler mærkes ved hjælp af fluorescerende proteiner (2008 Nobelprisen i kemi) og observeres i levende celler. Disse er blevet væsentlige værktøjer til observation inden for biovidenskab og medicinske områder.

Fasebilleddannelse bruger forskellen i den optiske længde af lys, når det passerer gennem en biologisk prøve til at afsløre strukturel information om det. Fluorescensbilleddannelse giver information om specifikke molekyler inde i den biologiske prøve, og kan afsløre deres funktioner. Imidlertid, den intracellulære struktur og motilitet er kompleks. Evnen til at visualisere multidimensionel fysisk information omfattende fase- og fluorescensbilleddannelse ville være nyttig til at forstå disse aspekter. Et billeddannelsessystem, der kunne generere varieret fysisk information samtidigt og øjeblikkeligt fra 3D-levende celler, ville tjene som en grundlæggende teknologi til at skabe innovation inden for biologi.

Det hybride multimodale billeddannelsessystem, der er konstrueret i denne undersøgelse, kan opnå fase- og fluorescerende 3D-information i et enkelt skud. Det gør det muligt for forskere at kvantitativt og samtidigt visualisere en biologisk prøves strukturelle eller funktionelle information ved hjælp af en enkelt platform.

Forskningsmetodologi

I dette studie, forskerne konstruerede et multimodalt digitalt holografisk mikroskop, der kunne optage en prøves fluorescerende information og faseinformation samtidigt (figur 1). Dette bruger digital holografi som base, hvorved forstyrret lysinformation fra objektet registreres og derefter optiske beregninger foretaget af computer bruges til at generere 3-D rumlig information om objektet.

Mikroskopet i undersøgelsen er sammensat af to forskellige optiske systemer. For det første, det holografiske 3-D fluorescens billeddannelsessystem, som vist på højre side af figur 1. For at opnå 3-D fluorescensinformation, en rumlig lysmodulator bruges til at opdele det fluorescerende lys, der udsendes fra fluorescerende molekyler, i to lysbølger, der kan interferere med hinanden.

På dette tidspunkt, 3-D informationen fra objektlyset bevares ved at give en af ​​lysbølgerne en lidt anderledes krumningsradius og udbredelsesretning; på samme tid, de to lysbølger er på en delt optisk vej (for det meste langs den samme akse), hvilket tillader en tidsmæssigt stabil interferensmåling. Dette optiske system blev formuleret i denne undersøgelse, afklaring af den registrerede interferensintensitetsfordeling for første gang. Denne formel gjorde det muligt for forskerne at finde eksperimentelle forhold, der ville forbedre kvaliteten af ​​de rekonstruerede fluorescerende billeder. De var i stand til at generere tredimensionelle billeder af levende celler og deres strukturer ved at anvende dette fluorescerende 3-D holografiske system. Molekylerne og strukturerne af levende celler blev mærket med fluorescerende proteiner, tillader deres dynamiske adfærd at blive observeret gennem denne nye 3-D fluorescensmikroskopi.

Billedteknologien udviklet af denne undersøgelse muliggør 3-D-billeder, som indtil nu har taget forholdsvis længere tid at generere via laserscanning, skal genereres i et enkelt skud uden behov for scanning.

Næste, som vist til venstre i figur 1, er det holografiske 3-D fase billeddannelsessystem. En levende plantecelle består af komponenter såsom en kerne, mitokondrier, kloroplaster, og en tynd cellevæg. Det er muligt at visualisere strukturerne af disse komponenter ud fra forskellene i fase (optisk vejlængde). I dette system, ved at anvende Mach-Zehnder-interferometeret kan referenceplanbølgen bruges, gør det nemt at opnå den optimale interferenskant for hvert målt objekt.

Dette digitale holografiske mikroskop blev skabt ved at forene fluorescens- og fasemålingssystemer.

Efterfølgende dette mikroskop blev brugt til at visualisere levende planteceller. Et eksperiment blev udført for at bevise, at det er muligt at udføre 4-D-observationer ved at anvende rumlig 3-D og en (en-dimensionel) tidsakse. Mosen Physcomitrella patens og fluorescerende perler med en gennemsnitlig størrelse på 10 μm blev brugt. Figur 2 og 3 viser forsøgsresultaterne for samtidig 3-D fluorescens og fasebilleddannelse af mosset. Figur 2 (b) viser, at syv kerner er synlige, når der anvendes et konventionelt fuldfelts fluorescensmikroskop. Af disse syv kernerne nummereret 1, 2, og 4 er i fokus, imidlertid, dette er ikke tilfældet for kernerne på steder i forskellige dybder, da det er et svagt fluorescerende billede med udbredt sløring. I denne undersøgelses foreslåede metode til at løse dette problem, fluorescerende lysbølgeinformation blev ekstraheret fra det fluorescerende hologram i figur 2 (c). Baseret på disse oplysninger, den numeriske Fresnel-udbredelsesalgoritme kan opnå rekonstruerede fluorescerende billeder i enhver dybde eller afstand. Derfor, i fokus billeder af flere fluorescerende kerner i forskellige dybder blev gendannet fra et enkelt billede uden scanning.

Figur 2 (d), (e), og (f) viser de rekonstruerede billeder i tre forskellige planer. Den aksiale afstand mellem (d) og (e) er 10 mikrometer, og 15 mikrometer mellem (e) og (f). De gule pile angiver de kerner, der er i fokus. Det er muligt at se, hvilke af de syv kerner i fluorescensbilledet, der er i fokus på tværs af de tre planer.

Figur 3 viser den kvantitative fasefordeling for de tre planer i forskellige dybder. Det var muligt at visualisere individuelle kloroplaster (der er mange rundt om kanterne af cellerne, som angivet ved de røde toppe i figur 3 (b)). Celletykkelsen, som beregnet ud fra de målte kvantitative faseværdier, var omkring 17 mikrometer, en størrelse meget tæt på andre referenceværdier.

I figur 4, du kan se fluorescerende perler (ca. 10 mikrometer i størrelse) flydende i en opløsning. Fase- og fluorescensinformationen blev genereret fra optagelser ved hjælp af den foreslåede metode. Perlerne bevæger sig også i dybderetningen, så det er muligt at hente deres 3D-position ved at ændre rekonstruktionsafstanden for at holde dem i fokus.

I dette studie, et multimodalt digitalt holografisk mikroskop blev udviklet, i stand til samtidige 3D-fase- og fluorescensmålinger. Med evnen til at udføre kvantitativ fase- og fluorescensbilleddannelse på samme tid, det menes, at denne metode vil tjene som en ny fundamentteknologi til visualisering af levende biologiske væv og celler. I særdeleshed, det har vist sig, at dette mikroskop kan anvendes på komplekse planteceller. Det kunne bruges til at opnå en diversificeret forståelse af stamcelledannelsesprocessen i planter, som formerer sig lettere end dyreceller. I fremtiden, det kan være muligt at bruge denne information til at kontrollere stamcellernes proces via stimulering med lys. Effektiv plantereproduktion og vækst opnået gennem den foreslåede billeddannelse og fremtidig stimulering kan anvendes til udviklingen af ​​et fødevaredyrkningssystem.

Denne teknologi kan udvikles ved yderligere at forbedre lysforbrugseffektiviteten. I digital holografi, det er nødvendigt at rumligt udvide strålediameteren, dele det op i to, og derefter overlappe dem igen for at bruge interferensen mellem de to lysveje. Derfor, det er også nødvendigt at øge den fluorescerende energi, for at den kan observeres af billedsensoren. For at opnå dette, en stor mængde lysenergi ville være nødvendig for at belyse de levende celler, imidlertid, cellulær skade forårsaget af lyset ville være et stort problem. Det menes, at et volumenhologram kunne bruges til at øge lysforbrugseffektiviteten og samtidig undgå cellulær fototoksicitet.

Et andet problem er, at den rekonstruerede 3D-fordeling strækker sig ind i lysets udbredelsesretning (objektets dybderetning), faldende aksial opløsning. Forskerne arbejder på metoder, der bruger dyb læring og filtrering for at undertrykke denne udvidelse i dybdegående retning og forbedre billedkvaliteten.