Holografisk fluorescensbilleddannelse til 3-D-spor ekstracellulære vesikler

Biologer bruger almindeligvis fluorescensmikroskopi på grund af teknikkens molekylære specificitet og superopløsning. Imidlertid, metoden tilbageholdes af billeddannelsesgrænser. I en ny rapport om Videnskab fremskridt , Matz Liebel og et forskerhold ved Barcelona Institute of Science and Technology og Massachusetts General Hospital i Spanien og USA rapporterede en billeddannelsesmetode til genopretning af det fulde elektriske felt af fluorescerende lys ved hjælp af enkeltmolekylær følsomhed. Teamet eksperimenterede med konceptet digital holografi til hurtig fluorescensdetektering ved at spore den tredimensionelle (3-D) bane af individuelle nanopartikler ved hjælp af en in-plane opløsning på 15 nanometer. Som bevis-på-koncept biologiske anvendelser, forskerne afbildede 3D-bevægelsen af ​​ekstracellulære vesikler inde i levende celler.

Nano levering i levende væv

I dette arbejde, Liebel et al. udviklet fluorescensholografibaseret 3-D-partikellokalisering på tværs af ekstracellulære vesikler inde i levende celler og observeret stærkt begrænsede vesikler med perioder med aktiv transport. Levering af godstransport in vivo er i øjeblikket en betydelig udfordring, for aktivt at implementere minimalt invasive nanomedicinplatforme. Nanopartikler (NP'er) og ekstracellulære køretøjer kan konstrueres som lovende kandidater til at levere som køretøjer, men forskere forstår endnu ikke den præcise rejse af sådanne enheder i levende væv.

For at overvinde disse udfordringer, de skal udvikle tredimensionale (3-D) billeddannelsesmetoder til bredfelt til at spore individuelle partikler samtidigt, når de rejser til deres påtænkte destination. Forskningshold havde tidligere implementeret holografiske tilgange til mikroskopi, selvom fluorescerende lyss usammenhæng ikke er velegnet til levende celler eller enkeltmolekylebilleddannelse. Sammenlignet med, klippeinterferometri er en lovende metode til at udføre single shot -optagelse af dynamiske processer. Den bagvedliggende idé bag forskydningsinterferometri inkluderer selvinterferens for at få adgang til fasegradienter ned til et enkelt fotoniveau for at opnå enkeltskudsfluorescensholografi. Mekanismerne udviklet i dette arbejde tjener derfor til at observere intracellulær translokation på tværs af mikrometerlængder for at give biologer en dybere indsigt i intracellulære mekanismer.

Billedprincip og systemvalidering til 3-D partikelsporing

Teamet brugte et fluorescensmikroskop med bredt felt med en bølgefrontskæringssensor bestående af et relæbilleddannelsessystem. Opsætningens geometri sikrede, at fase-gradienter uden nul blev målt og tillod Liebel et al. at udføre enkelt-foton selvinterferens på tværs af et helt billede. Teamet afbildede fluorescerende polystyrenperler som 200 nm partikler uden for fokus og ekstraherede intensitetsoplysningerne som argumentmodul for de filtrerede billeder til fasegradientekstraktion. Efter at have observeret det fulde elektriske felt, de brugte Fourier-optik til at korrigere komplekse spredningsinducerede aberrationer eller konstruere billeder på et hvilket som helst plan. Teamet fokuserede på 3-D lokaliseringseksperimenter, der kræver genopretning af den præcise position af en emitter af interesse på tværs af alle dimensioner, herunder Z-flyet. Beregningsfokuseringsindsats angav den præcise evne til at bestemme 3D-positionen af ​​flere frit diffunderende fluorescerende partikler.

Test af den beregningsmæssige fokusbane

For at teste beregningsmæssige begrundelser bag opsætningen, Liebel et al. genererede en kendt 3D-bane og flyttede en prøve, der indeholdt immobiliserede fluorescerende perler-under optagelse af billeder langs stien. De genvundet fase- og amplitudeoplysningerne og bestemte 3-D-positionerne for individuelle partikler ved hjælp af numerisk udbredelse. For at kvantificere det tilgængelige Z-område, de fokuserede eksperimentelt på individuelle partikler og fokuserede derefter beregningsmæssigt billederne igen for at opnå artefaktfrie målinger på tværs af et Z-område på cirka otte µm. Det er vigtigt at sikre præcis nanoskala lokalisering på tværs af mikrometerlængder i 3-D til billedspredende nanoskala partikler. Fluorescensholografi opfyldte disse krav. Som bevis på konceptet, forskerne afbildede ordet "holografi, "hvor hvert enkelt inputbogstav var mindre end 50 nm i bredden for at opnå et godt opløst output, bekræfter superopløsningskapaciteten af ​​fluorescerende holografi.

Enkeltmolekylebilleddannelse og cellulær optagelse af nanopartikler

Teamet viste, hvordan fluorescensholografi fungerede under biologisk vigtige superopløsningsbetingelser ved at måle en prøve sammensat af individuelle molekyler. På trods af markant reducerede fluorescensintensiteter i den eksperimentelle opsætning, holdet opnåede beregningsfokus til diffraktionsgrænsen, selv for fotonniveauer så lave som 10 ⁴ fotoner. De visualiserede intracellulær handel med uorganiske nanopartikler og ekstracellulære vesikler ved hjælp af systemet. Som et modelsystem, de brugte fluorescensmærkede guldnanoroder, der er inaktive og derfor uden forstyrrelse af cellulære funktioner til at akkumulere i cytoplasmaet som verificeret ved hjælp af mørkefeltbilleder af levende celler. Holdet fulgte partikernes baner ved at optage time-lapse fluorescensbilleder og ekstraherede fase- og amplitudebetingelserne. De meget varierende punktspredningsfunktioner (PSF'er) indikerede tilstedeværelsen af ​​nanoroder i forskellige Z-positioner i forhold til brændplanet.

Teamet udførte 3D-lokalisering af hver enkelt nanorod i cellen og rekonstruerede partikelbaner på tværs af 100 observationsrammer for at opnå seks repræsentative kategorier, hvor nogle partikler var ubevægelige i løbet af de 200 sekunders observationstid, mens andre frit diffunderer over flere mikrometer. De resterende partikler viste både bundne og diffunderende tilstande. På denne måde, den underliggende fluorescensholografimetode kunne præcist bestemme 3D-positioner.

Cellular optagelse og aktiv transport af ekstracellulære vesikler

Liebel et al. undersøgte derefter den aktive 3D-transport af ekstracellulære vesikler (EV'er) inde i levende celler ved at inkubere HeLa-celler med fluorescensmærkede EV'er. De erhvervede fluorescerende hologrammer hvert fjerde sekund for at rekonstruere 3-D-baner for individuelle EV'er gennem en kombination af automatiserede og manuelle baner, sammenkædning af 3D-positionerne. Liebel et al. overlejrede time-lapse amplitude fremskrivninger af fluorescerende hologrammer med samtidig optagede lysfeltbilleder af individuelle celler, for at vise, hvordan de fleste elbiler var lokaliseret ved kanten af ​​de vedhæftende celler. Observationerne og beregningerne antydede, at elbiler var fanget inde i et område, begrænser deres bevægelse til et bestemt volumen; sandsynligvis tilhører det cellulære cytoskelet.

Outlook

På denne måde, Matz Liebel og kolleger udtænkte en stor single-shot fluorescensholografimetode med enkelt skud for at tillade 3-D enkeltpartikelsporing på tværs af et Z-område på cirka otte mikrometer. For at bevise dette koncept, teamet implementerede en let eksperimentel opsætning med en optimeret foton gennemstrømning. De optimerede funktioner tillod fluorescensholografi at være en ideel tilgang til at studere partikelsporing i realtid. Teamet viste 3-D enkeltpartikelsporing og observerede bevægelse af nanoskalaobjekter i levende celler, såsom fluorescensmærkede guldnanoroder og EV'er (ekstracellulære vesikler). Mens guld nanoroder kun aggregerede i cytoplasma uden internalisering i kernen, EV'erne akkumulerede ved kanterne af vedhæftende celler i en trængende effekt. Liebel et al. forventer at foretage yderligere farvning for at identificere det intracellulære cytoskelet, derved forbinder den intracellulære arkitektur med bevægelsen af ​​ekstracellulære vesikler. Disse bestræbelser vil kaste lys over de præcise mekanismer for godstransport og partikel internalisering inde i celler med vigtige anvendelser inden for nanomedicin til at besvare kritiske spørgsmål inden for biologi og medicin. Mekanismen er lige så velegnet til at udføre andre volumetriske billeddannelsesmetoder til at spore inde i væv og til biokemisk calciumbilleddannelse.

© 2020 Science X Network