Vibrationsmikroskopi går super opløsning

Ægte superopløsningsbilleddannelse ud over diffraktionsgrænsen er fortsat en stor udfordring for fjernfelt Raman-mikroskopi, især i biologiske applikationer. Udnyttelse af Stimuleret Raman Excited Fluorescence (SREF) som en ultrafølsom vibrationskontrast, et hold ved Columbia University har for nylig opfundet en ny super-opløsning vibrationsmikroskopi. Deres nye metode åbner op for superopløsning, nanometer-spektral opløsning flerfarvet vibrationsbilleddannelse af biologiske systemer.

Det har været en lang stræben efter at udvikle super-opløsning billedbehandlingsteknikker til Raman mikroskopi, som har iboende fordele ved kemisk specificitet i forhold til dets fluorescensmodstykke. På trods af den opfattede betydning og omfattende forskningsindsats, ægte superopløsning (defineret som diffraktion-ubegrænset) Raman-billeddannelse af biologiske systemer i det optiske fjernfelt forbliver udfordrende på grund af manglen på følsomhed for konventionel Raman-spredning. Følgelig, disse rapporterede super-opløsning vibrationelle billeddannelsesmetoder er baseret på excitationsmætning, udtømmende, eller højordens ikke-linearitet af Raman-overgangene. Disse kræver ekstremt intens laserkraft for at opnå en moderat opløsningsforbedring (ofte mindre end en faktor på 2), som hæmmer dets anvendelighed til biologisk anvendelse.

I et nyt blad udgivet i Lys:Videnskab og applikationer , et hold af videnskabsmænd, ledet af professor Wei Min fra Columbia University, USA, har udviklet en ny super-opløsning vibrationsmikroskopi, der udnytter Stimulated Raman Excited Fluorescence (SREF) som en ultrafølsom vibrationskontrast. SREF kobler vibrationsexcitationen med fluorescensdetektion og muliggør Raman-spektroskopi med følsomhed ned til et enkelt molekyle. Imidlertid, direkte kobling af stimuleret emissionsdepletering (STED) med SREF-billeddannelse mislykkes i at opnå superopløsningsbilleddannelse på grund af tilstedeværelsen af ​​anti-stokes fluorescensbaggrunden, som ikke kan udtømmes af STED-strålen.

I dette nye værk, holdet udtænkte en frekvensmodulationsstrategi (FM) for at fjerne denne bredbåndsbaggrund. Ved midlertidigt at modulere excitationsfrekvensen til og fra den målrettede vibrationsresonans, men stadig inden for baggrundens brede linjebredde, de kan generere en intensitetsmodulation på det rene vibrationssignal (men ikke på baggrunden). Det baggrundsfrie vibrationssignal kan efterfølgende demoduleres ved en lock-in-detektion. Sammenligning med det typiske rå SREF-spektrum, spektret erhvervet af FM-SREF repræsenterer det rene SREF-signal, som muliggør baggrundsfri SREF-billeddannelse med høj kontrast. De syntetiserede yderligere nye isotopredigerede SREF-farvestoffer for at lette flerfarvet FM-SREF biologisk billeddannelse med skarp vibrationskontrast. To vibrationsfarver er adskilt af FM-SREF med minimal krydstale, hvilket er næsten umuligt ved konventionel fluorescensmikroskopi. En sådan kemisk specificitet af vibrationsbilleddannelse har unikke fordele for multiplekset optisk billeddannelse.

Endelig, ved at integrere STED med baggrundsfri FM-SREF, de opnåede vibrationsbilleder med høj kontrast og superopløsning med STED-FM-SREF, hvis rumlige opløsning kun bestemmes af signal-til-støj. De demonstrerede mere end to gange opløsningsforbedring i biologiske systemer med moderat laserexcitationskraft. Med fremtidig optimering af instrumenterings- og billeddannelsesproberne, STED-FM-SREF-mikroskopi er forudset til at hjælpe en bred vifte af biologiske applikationer, med sin fremragende opløsning, høj følsomhed, unik vibrationskontrast, og biokompatibel excitationskraft.