Excitationsspektral mikroskopi integrerer billedbehandling med flere mål og kvantitativ biosensering

Multiplexeringskapaciteten ved fluorescensmikroskopi er stærkt begrænset af den brede fluorescensspektralbredde. Spektral billeddannelse tilbyder potentielle løsninger, alligevel typiske tilgange til at sprede de lokale emissionsspektre hindrer især den opnåelige gennemstrømning og sætter betydelige begrænsninger for tidsopløsning. Afstembare båndpasfiltre giver mulighed for at scanne gennem emissionsbølgelængden i det brede felt. Imidlertid, anvendelse af smalle båndpasninger til fluorescensemissionen resulterer i ineffektiv brug af det knappe signal.

I et nyt papir udgivet i Lys:Videnskab og applikationer , et hold forskere, ledet af professor Ke Xu fra College of Chemistry, University of California, Berkeley, USA har demonstreret, at ved hjælp af en enkelt, fast fluorescensemissionsdetekteringsbånd, gennem rammesynkroniseret hurtig scanning af excitationsbølgelængden fra en hvid lampe via et akustisk-optisk afstembart filter (AOTF), op til 6 subcellulære mål, mærket med almindelige fluoroforer med betydelig spektral overlapning, kan samtidigt afbildes i levende celler med lav (~ 1%) krydstale og høj tidsmæssig opløsning (ned til ~ 10 ms).

Den demonstrerede evne til at kvantificere mængden af ​​forskellige fluoroforer i den samme prøve ved at blande excitationsspektrene derefter gjorde det muligt for dem at udtænke nye, kvantitative billeddannelsesordninger for både bi-state og FRET (Förster resonance energy transfer) fluorescerende biosensorer i levende celler. De opnåede således høje følsomheder i fuld ramme og spatiotemporale opløsninger i kvantificering af mitokondrie matrix pH og den intracellulære makromolekylære trængsel. De afslørede således betydelige rumlige heterogeniteter i begge parametre, herunder spontane pludselige spring i mitokondriens matrix pH ledsaget af dramatiske mitokondrielle formændringer. De demonstrerede yderligere, for første gang, multiplexering af absolut pH -billeddannelse med tre yderligere målorganeller/proteiner for at belyse komplekset, Parkin-medieret mitophagy-vej.

"Den potentielle udvidelse af vores tilgang til endnu flere fluoroforer kan opnås ved yderligere at øge antallet af excitationsbølgelængder eller integrere emissionsspredning. Mens vi i dette arbejde fokuserede på et let system baseret på et lampedrevet epifluorescensmikroskop, de hurtige multi-fluorofor- og kvantitative biosensor-billeddannelsesegenskaber, vi demonstrerede her, bør let kunne udvides til andre systemer, herunder lysarkfluorescensmikroskopi og struktureret belysningsmikroskopi, kommenterede forskerne.

Sammen, disse resultater "afslører de usædvanlige muligheder, excitationsspektralmikroskopi giver mulighed for stærkt multiplexeret fluorescensbilleddannelse. Udsigten til at erhverve hurtige spektralbilleder i det brede felt uden behov for fluorescensdispersion eller pleje af detektorens spektralrespons giver et enormt potentiale, "konkluderer forskerne.