En ny lysarkmikroskopienhed muliggør et udvidet synsfelt og reduceret fotoskader

En forskergruppe ledet af Takashi Saito, fra Ehime University Graduate School of Medicine, udviklet et 2-foton excitationslysark fluorescensmikroskop, som (1) sænker fototoksiciteten, (2) udvider synsfeltet, og (3) øger den rumlige opløsning. Dette mikroskop, når det bruges til observation af medaka fisk, gjort det muligt at observere hele embryonets krop (et udvidet synsfelt) på cellulært niveau opløsning (høj rumlig opløsning) uden at påvirke fiskens vækst (lav fototoksicitet) over en tre-dages periode af embryonal udvikling. Dette resultat blev offentliggjort i det videnskabelige tidsskrift Naturkommunikation .

Fluorescensmikroskopet er meget brugt inden for biovidenskab til at observere molekyler inde i en celle på en ikke-invasiv måde. Light-sheet fluorescensmikroskopi gør det muligt at optage tredimensionelle billeder med høj optagelseshastighed og høj rumlig opløsning. Imidlertid, i konventionelle lysarkmikroskoper, det er svært at begrænse fotoskader til levende væv, og også vanskeligt samtidig at opnå bred FOV og høj (celleniveau) rumlig opløsning.

Udvikling af en to-foton excitation bredfelt, lysarkmikroskop

Ehime University forskningsgruppe i Takashi Saitou, Sota Takanezawa, og Takeshi Imamura brugte to-foton-excitationsfænomenet som en nøgle til at løse dette problem. To-foton excitationsmikroskopet med infrarøde lasere muliggør skånsom (lav fototoksisk) billeddannelse af levende organismer. Imidlertid, fordi lyset skal fokuseres på et snævert område for at inducere to-foton excitation, excitationsområdet (i lysarkmikroskop, synsfeltet) er smalt. For at løse dette, forskerne udviklede en simpel belysningsoptikenhed med en Bessel-stråle, der udvider laserudbredelsesområdet i retning af den optiske akse (fig. 1A). Denne enhed kan strække strålelængden til 600-1000 μm, mens den bibeholder en aksial opløsning på 2-3 μm, når der bruges en 10x forstørrelse NA0.3 objektivlinse. Ved at bruge denne optiske enhed, de konstruerede en to-foton excitationslysarkmikroskopi (fig. 1B), hvilket gør det muligt at udføre helkropsbilleddannelse af medaka-larver med cellulær opløsning (fig. 1C).

Medakaen er meget brugt som modelorganisme for hvirveldyr. Den er velegnet til fluorescerende billeddannelse, da den er lille og gennemsigtig. For at vurdere anvendeligheden af ​​mikroskopet til brug på levende organismer, forskerne udførte en fototoksicitetsvurdering. Dette afslørede reduceret fotoskader sammenlignet med det konventionelle gaussiske lysarkmikroskop. Det foreslås derfor at være egnet til langtids levende billeddannelse. Forskerne anvendte derefter langsigtet time-lapse-billeddannelse af den transgene medaka, hvor lymfatisk endotel er mærket med grønt fluorescerende protein, og lykkedes med levende billeddannelse over tre dage med intervaller på fem minutter (fig. 2).

I dette studie, forskerne udviklede et nyt højtydende lysark-fluorescensmikroskop. Ved at bruge denne teknologi, forskere kan observere næsten alle de embryonale vækstprocesser af medaka fisk med høj cellulær opløsning over hele fiskens krop. Denne teknologi forventes at bidrage til forståelsen af ​​embryonal udvikling på molekylært niveau, belysning af patogenesen for livsstilsrelaterede sygdomme, og at fremme teknologien til lægemiddeludvikling.