Kalibreringsmetode gør det muligt for mikroskoper at foretage nøjagtige målinger i alle 3 dimensioner

Konventionelle mikroskoper giver vigtige oplysninger om prøver i to dimensioner - mikroskopets objektglas. Men fladt er ikke alt det. I mange tilfælde, oplysninger om objektet i den tredje dimension - aksen vinkelret på mikroskopglaset - er lige så vigtig at måle.

For eksempel, at forstå funktionen af ​​en biologisk prøve, om det er en DNA -streng, væv, organ eller mikroskopisk organisme, forskere vil gerne have så meget information, som de kan få om objektets tredimensionelle struktur og bevægelse. To-dimensionelle målinger giver en ufuldstændig og undertiden utilfredsstillende forståelse af prøven.

Nu har forskere ved National Institute of Standards and Technology (NIST) fundet en måde at konvertere et problem, der påvirker næsten alle optiske mikroskoper - linseaberrationer, som forårsager ufuldkommen fokusering af lys - til en løsning, der gør det muligt for konventionelle mikroskoper nøjagtigt at måle positionerne af lyspunkter på en prøve i alle tre dimensioner.

Selvom andre metoder har gjort det muligt for mikroskoper at give detaljerede oplysninger om tredimensionel struktur, disse strategier har haft en tendens til at være dyre eller kræve specialiseret viden. I en tidligere tilgang til måling af positioner i den tredje dimension, forskere ændrede optikken i mikroskoper, for eksempel ved at tilføje ekstra astigmatisme til linserne. Sådanne ændringer krævede ofte ombygning og kalibrering af det optiske mikroskop, efter at det forlod fabrikken.

Den nye målemetode gør det også muligt for mikroskoper at lokalisere objekternes position mere præcist og præcist. Optiske mikroskoper løser typisk objekternes positioner til et område, der ikke er mindre end et par hundrede nanometer (milliarddeler af en meter), en grænse fastsat af lysets bølgelængde, der skaber billedet og mikroskoplinsernes opløsningsevne. Med den nye teknik, konventionelle mikroskoper kan lokalisere placeringen af ​​individuelle lysemitterende partikler inden for et område på en hundredel som lille.

NIST -forskere Samuel Stavis, Craig Copeland og deres kolleger beskrev deres arbejde i udgaven af ​​24. juni Naturkommunikation .

Metoden bygger på en omhyggelig analyse af billeder af fluorescerende partikler, som forskerne aflejrede på flade siliciumskiver til kalibrering af deres mikroskop. På grund af linseavvigelser, da mikroskopet bevægede sig op og ned med bestemte trin langs den lodrette akse - den tredje dimension - virkede billederne skæve, og partiklernes former og positioner syntes at ændre sig. NIST -forskerne fandt ud af, at afvigelserne kan producere store forvrængninger i billeder, selvom mikroskopet kun bevæger sig et par mikrometer (milliontedele af en meter) i sideplanet eller et par titalls nanometer i den lodrette dimension.

Analysen gjorde det muligt for forskerne at modellere præcis, hvordan linseaberrationer ændrede udseende og tilsyneladende placering af fluorescerende partikler med ændringer i den lodrette position. Ved omhyggeligt at kalibrere det skiftende udseende og tilsyneladende placering af en partikel til dens lodrette position, det lykkedes teamet at bruge mikroskopet til nøjagtigt at måle positioner i alle tre dimensioner.

"Modsat, linseaberrationer begrænser nøjagtigheden i to dimensioner og muliggør nøjagtighed i tre dimensioner, "sagde Stavis." På denne måde, vores undersøgelse ændrer perspektivet på dimensionaliteten af ​​optiske mikroskopbilleder, og afslører potentialet for almindelige mikroskoper til at foretage ekstraordinære målinger. "

Brug af den latente information fra linseaberrationer supplerer de mindre tilgængelige metoder, som mikroskopere i øjeblikket anvender til at foretage målinger i den tredje dimension, Bemærkede Stavis. Den nye metode har potentiale til at udvide tilgængeligheden af ​​sådanne målinger.

Forskerne testede deres kalibreringsmetode ved at bruge mikroskopet til at forestille en konstellation af fluorescerende partikler afsat tilfældigt på et mikroskopisk siliciumudstyr, der roterede i alle tre dimensioner. Forskerne viste, at deres model nøjagtigt blev korrigeret for linseavvigelser, gør mikroskopet i stand til at levere fuldstændig tredimensionel information om partiklernes position.

Forskerne kunne derefter udvide deres positionsmålinger for at fange hele bevægelsesområdet for gearet, herunder roterende, vaklende og vuggende, færdiggørelse af ekstraktion af rumlig information fra systemet. Disse nye målinger fremhævede konsekvenserne af nanoskala mellemrum mellem mikrosystemdele, som varierede på grund af mangler i systemets fremstilling. Ligesom et løst leje på et hjul får det til at vingle, undersøgelsen viste, at hullerne i nanoskala mellem dele ikke kun forringede præcisionen af ​​den forsætlige rotation, men forårsagede også utilsigtet vakling, vippe og endda bøje gearet, som alle kunne begrænse dens ydeevne og pålidelighed.

Mikroskopilaboratorier kunne let implementere den nye metode, Sagde Copeland. "Brugeren har bare brug for en standardprøve for at måle deres effekter og en kalibrering for at bruge de resulterende data, "tilføjet Stavis. Bortset fra de fluorescerende partikler eller en lignende standard, som allerede eksisterer eller er ved at dukke op, der er ikke behov for ekstra udstyr. Den nye tidsskriftartikel indeholder demonstrationssoftware, der guider forskere i, hvordan man anvender kalibreringen.