Teamet opdager enzymdomæner, der dramatisk forbedrer ydeevnen

Det var mere end 10 år undervejs, men da det kom til at afdække hemmelighederne ved enzymers molekylære struktur, vedholdenhed gav pote. Ved at studere og sammenligne arbejdshesten cellulose-nedbrydende enzymer af to svampe, forskere fra Energy Department's National Renewable Energy Laboratory (NREL) har lokaliseret områder på disse enzymer, der kan målrettes via genteknologi for at hjælpe med at nedbryde cellulose hurtigere.

Nyligt udgivet i Naturkommunikation , "Ingeniørforbedret cellobiohydrolaseaktivitet" beskriver NRELs mangeårige undersøgelse af svampecellobiohydrolaser (CBH'er)-enzymer, der bruger hydrolyse som deres vigtigste kemi til at nedbryde cellulose- Trichoderma reesei (TrCel7A) og Penicillium funiculosum (PfCel7A). År med omhyggelig forskning har givet store belønninger:teamet har fået en bedre forståelse af struktur-aktivitetsforholdene mellem disse enzymer for at forudsige de bedste steder at foretage ændringer og forbedringer.

Både i natur- og industriprocesser, enzymer fra denne familie er blandt de mest betydningsfulde enzymer til nedbrydning af cellulose. Et forventet 2, 000-ton-per-dag celluloseholdig ethanolfabrik kan potentielt bruge op til 5, 000 tons enzym om året, og halvdelen af ​​den enzymcocktail kunne være fra denne enzymfamilie. "Der har været et driv i de sidste årtier med at forsøge at forstå og forbedre biokatalysatorer fra denne centrale enzymfamilie, "sagde Gregg Beckham, gruppeleder på NREL og seniorforfatter af undersøgelsen. "Jo mere effektivt enzymet, det mindre anvendte enzym, og dermed er processen billigere. Imidlertid, vi har stadig en lang vej at gå for at kunne foretage forbedringer i en forudsigelig kapacitet. "

Derefter, i 2005, NREL -forskere Mike Himmel, Steve Decker, og Bill Adney opdagede en CBH fra en anden svamp, PfCel7A, og fandt ud af, at den klarer sig 60 procent bedre end TrCel7A. "Det overraskede os, at dette enzym var så meget bedre end branchestandarden, sagde Decker, der ledede opgaven, efter at Adney forlod NREL. "Vi har kørt mange eksperimenter i løbet af de sidste par år for at være sikre på, at aktiviteten var ægte. Derefter, selvfølgelig, Vi ville vide, hvorfor det var bedre. "

"Hvis vi kunne forstå de strukturelle forskelle, så kunne vi potentielt bruge disse oplysninger til at konstruere bedre enzymer, hvilket igen kunne bidrage til at reducere omkostningerne ved cellulosebiobrændsel og biokemisk produktion, "sagde Beckham." I betragtning af udfordringen med at arbejde med disse enzymer, det tog NRELs team syv års grundigt eksperimentelt arbejde at udvikle de nødvendige værktøjer til at fastslå, at der er et par hotspots på disse to CBH'er, der kan ændres for at få dem til at fungere bedre. "

Ifølge Decker, "Dengang, værktøjer til genteknologi i Trichoderma var meget begrænsede, men vi vidste fra tidligere arbejde, at andre værter havde problemer med at udtrykke disse proteiner. Vi startede stort set forfra og byggede vores eget interne T. reesei-system af værtsstammer, vektorer, og transformations- og screeningsprotokoller. Sammenlignet med veludviklede systemer som E. coli, T. reeseis dårlige transformationseffektivitet, kedelige udvælgelsesprocesser, langsom vækst, og lavt proteinudbytte gjorde dette til en udfordrende operation. Hver stamme, vi byggede, tog måneder fra design til afsluttende test. "

Opdagelsen udfoldede sig, da NREL kiggede tæt på lighederne mellem TrCel7A og PfCel7A og arbejdede derefter med at isolere forskellene. Begge enzymer har en tre-domæne arkitektur:det kulhydratbindende molekyle, der binder det til cellulose; det katalytiske domæne, der nedbryder cellulose; og linket, der forbinder disse to domæner sammen. Forskerteamet gennemførte derefter eksperimenter med bytte af domæner ved at oprette et kimærbibliotek, som er en samling af mutante enzymer skabt af de to forældreenzymer.

"Med tre domæner mellem to forældre, det giver otte kombinationer i alt, "sagde Beckham." Vi testede de forskellige kombinationer for at finde ud af, hvilket område der giver enzymet bedre ydeevne, og måske ikke overraskende, set i bakspejlet, det er det katalytiske domæne. "

Med disse fund, forskerne sammenlignede derefter de katalytiske domæner for TrCel7A og PfCel7A og fandt otte områder, der var forskellige. Fortsætter med at indsnævre mulighederne, holdet tog TrCel7A -forælderen og foretog ændringer, en ad gangen, på de otte områder og afdækkede to vigtige ændringer, der resulterede i, at TrCel7A klarede sig næsten på niveau med PfCel7A -forælderen.

"De to, meget små ændringer på dette enorme protein fordobler dybest set TrCel7A's ydeevne, "sagde Beckham." Hvad dette lærer forskere, der laver proteinteknik på disse utroligt udfordrende enzymer, er, at der er meget små ændringer i dette katalytiske domæne, der kan ændres for dramatisk at påvirke enzymets ydeevne, gør den i stand til at nedbryde cellulose hurtigere og dermed tillade industrielle processer at bruge mindre enzym. "

"Vi vidste, at opdagelsen af ​​PfCel7A var vigtig på det tidspunkt, men vejen frem var ikke helt klar, "sagde Himmel, den overordnede projektleder. "Vi tacklede den sværeste familie af cellulaser at forbedre først, og derfor følger det, at biomasse-nedbrydende enzymer fra andre familier kan gøres maksimalt aktive i en mere strømlinet proces, med mindre forskning og udvikling. Det var sammensmeltningen af ​​eksperimentel biokemi og beregningsvidenskab, der bragte denne undersøgelse til Naturkommunikation og det resultat var kun muligt med vedvarende finansiering fra Bioenergy Technologies Office. "

NREL -teamets ultimative mål er at hjælpe andre forskere med at sile gennem bjerget af genomiske data for at finde bedre enzymer, alene baseret på deres genetiske sekvens. "Om 10 år, det ville være så spændende at kunne sidde ned med tusinder af enzymsekvenser fra denne familie og være i stand til at forudsige, hvilke få der skal prøve, "sagde Beckham." Denne undersøgelse er et skridt på en meget lang vej, men det er et værdigt mål. "