Teknik til at finjustere to-komponent biologiske sensorer

Rice University-forskere, der siger, at biologiske sensorer ikke er følsomme nok, gør noget ved det.

Laboratoriet af syntetisk biolog Jeffrey Tabor har introduceret en ny teknik til at skrue op eller ned for følsomheden af ​​to-komponent systemer - en klasse af proteiner, som bakterier bruger til at fornemme en bred vifte af stimuli.

Teknikken kunne muliggøre konstruktion af skræddersyede biosensorer til diagnostiske tarmbakterier, påvisning af miljøforurenende stoffer eller automatiseret kontrol af næringsstofniveauer i jorden.

To-komponent sensorer, fokus i et nyt papir, der beskriver arbejdet i Nature Communications, er en stor familie af genetisk kodede sensorer, som bakterier bruger til at fornemme et specifikt input og tænde for et specifikt gen som reaktion på ændringer i deres miljø.

Mens disse sensorer har været kendt i tre årtier, de var ikke følsomme nok for Tabor. Han og Rice-alumnen og hovedforfatteren Brian Landry satte sig for at reducere mængden af ​​input, der er nødvendig for at tænde dem.

Ved at kombinere computermodellering og eksperimenter, de opnåede netop det. I avisen, de beskriver deres opdagelse af, at fosfataseaktivitet, som er afgørende for regulering og signalering i celler, kan have en dramatisk effekt på detektionstærsklerne for to-komponentsystemer.

Tidligere forskning havde vist, at mutationer til den første komponent, et signalsensorprotein kendt som en histidinkinase, kan bruges til at kontrollere omfanget af phosphorylering af den anden komponent, et responsregulatorprotein. Men ingen havde foreslået, at fosfatasemutationer kunne bruges til at ændre følsomheden af ​​disse veje for deres input, sagde Tabor.

En dag, konfronteret med en nitratsensor, der ikke tændte som forventet i tarmen på en syg mus, Landry antog, at phosphatasemutationer dramatisk kunne øge pathwayens følsomhed.

Han validerede først hypotesen ved hjælp af en matematisk model og udførte derefter eksperimenter, der viste, at mutationerne øgede effektiviteten af ​​en nitratsensor med en faktor på 100. Tabors laboratorium fortsatte med at validere tilgangen i to-komponent systemer, der registrerer en bred vifte af input , selv hos meget forskellige bakteriearter.

Landry arbejdede sammen med en anden Rice bioingeniørstuderende, medforfatter Lucas Hartsough, at identificere en "hot spot"-aminosyre til stede i 64 procent af alle sensorhistidinkinaser, der kan muteres for at justere følsomheden. De validerede tilgangen i to minimalt karakteriserede veje, hvilket antydede, at det kan anvendes bredt, sagde Tabor.

Landry brugte også teknologien til at konstruere en jordbakterie, Bacillus subtilis, at fornemme og reagere på en bred vifte af nitrat (gødning) koncentrationer i jorden. Tabor og Landry foreslår, at dette system kunne kobles til veje under udvikling af en kollega ved MIT, syntetisk biolog Chris Voigt, og hans laboratorium til at konstruere jordbakterier, der opretholder optimale nitrogenniveauer i jorden uden behov for gødning.

To-komponent systemer kan udløses af mange slags input, herunder gasser, hæm molekyler i blodet, sukkerarter, tarm polysaccharider, menneskelige eller plantehormoner eller endda lys.

"Det er derfor, vi er så begejstrede for det her, " sagde Tabor. "Disse sensorer fungerer alle på samme måde. De har alle fosfatasen og kinasen. Vi har identificeret over 25, 000 af dem i bakterielle genomer, og vi tror, ​​at vores strategi vil fungere på de fleste af dem."

Han sagde, at hans laboratoriums teknik er afhængig af signalvejen, hvorved naturlige sensormolekyler fortæller cellerne at stoppe, starte eller ændre produktionen af ​​proteiner. Tuning af naturlige sensorer til syntetiske applikationer har været svært indtil nu, han sagde.

"En af de store begrænsninger er, at når man tager en biosensor fra naturen, det kan fornemme det kemikalie, du er interesseret i, men ikke i den rigtige koncentration. Dette skyldes, at det har udviklet sig til at tillade en bakterie at overleve bedre i et naturligt miljø frem for at tilfredsstille en syntetisk biologs tekniske behov. " han sagde.

"Vi kalder dette niveau for detektionstærsklen for sensoren, og der har ikke været mange gode teknologier til at justere denne tærskel til at matche vores tekniske behov, " sagde Tabor. "Det har været en væsentlig begrænsning i biosensordesign. Men nu, vi har fundet et generelt trick, der giver os mulighed for at justere detektionstærsklerne for denne familie af bakteriesensorer på en meget rationel måde, og det fungerer ganske godt."

I sine simuleringer og eksperimenter, laboratoriet muterede histidin kinase-proteinet, som detekterer et input og frigiver en fosfatgruppe, der binder sig til responsregulatoren. At, på tur, binder til DNA for at aktivere genekspression.

"Når du tænder for genekspression, det er dit signal, " sagde Tabor. "Det, der er cool ved disse veje, er, at når input er fraværende, sensoren histidin kinase fungerer som en fosfatase i stedet og fjerner fosfatgruppen. Når det sker, responsregulatoren falder af DNA'et og aktiverer ikke længere genekspressionen."

Han sagde, at mutation af histidinkinasen for at favorisere at tænde eller slukke for signalet kan bruges til at kontrollere reaktionsregulatorernes handlinger, og dermed mængden af ​​ønskede proteiner produceret.

"Vi ræsonnerede, at det er som et tovtrækkeri mellem kinaseaktiviteten og fosfataseaktiviteten, " sagde Tabor. "Den balance bestemmer, hvor meget input der skal til for at tænde sensoren. Så det er som en knap, hvor vi kan gøre fosfataseaktiviteten stærkere eller svagere for at justere inputtet."

Han sagde, at processens generelitet burde øge syntetisk biologi generelt. "Der er alternative metoder til at gøre det, vi gjorde her, men de er langt mere arbejdskrævende, " sagde Tabor. "De er mere tilbøjelige til at fejle, og de ville tage en hel ph.d. at få dem til at arbejde, hvorimod vi kan gøre dette på en uge og få det til at fungere."