Mærkning og påvisning af RNA -ændringer

Hvad sker der i en celle, når genetisk information oversættes til proteiner? For at studere denne proces, forskere studerer et bestemt biomolekyle inde i cellen:messenger ribonukleinsyre, mRNA for kort. Dette biomolekyle spiller en stor rolle i alle cellulære processer-og det er også fokus for fælles forskning, der udføres af to grupper ved Cells-in-Motion Cluster of Excellence ved Münster University. En af grupperne består af biokemikere og ledes af prof. Andrea Rentmeister; den anden består af molekylære biologer og ledes af Dr. Sebastian Leidel.

I deres tværfaglige samarbejde, det er lykkedes forskerne for første gang at kemo-enzymatisk mærke en vigtig ændring i messenger-RNA-den såkaldte m6A-modifikation-og efterfølgende opdage det ved hjælp af moderne molekylærbiologiske metoder. "Denne nye tilgang gør det muligt for os at lokalisere ændringer i mRNA med en større grad af nøjagtighed end nogensinde før, "siger Andrea Rentmeister, en professor ved Cluster of Excellence, der ledede undersøgelsen. At vide, hvor og i hvilket omfang m6A -ændringer forekommer, kan hjælpe forskere med at forstå denne ændring i fysiologiske og patologiske processer. Undersøgelsen er blevet offentliggjort i Angewandte Chemie (International Edition) tidsskrift.

DNA'ets genetiske information transkriberes til messenger -RNA i en proces kendt som transkription. Efter transskription, mRNA transporterer den genetiske information fra cellekernen ind i cytoplasmaet. Der, det fungerer som en vejledning til produktion af proteiner. Proteiner er arbejdshestene, der udfører alle cellulære opgaver.

Ligesom dobbeltstrenget DNA, enkeltstrenget RNA består af en kæde af såkaldte nukleotider. I RNA, imidlertid, der er også mange kemiske ændringer i disse nukleotider - kendt som RNA -modifikationer. Disse ændringer sker efter, at de genetiske oplysninger er blevet læst. I processen, simple atomarrangementer - methylgrupperne - er knyttet til nukleotiderne. "En ændring, der i øjeblikket diskuteres heftigt, er N6-methyladenosin, kendt som m6A for kort, "siger Andrea Rentmeister. Denne ændring er meget interessant, fordi den ser ud til at være ansvarlig for en række biologiske processer, herunder døgnrytmen. Det ser også ud til at spille en rolle i patologiske processer, for eksempel i nogle former for kræft eller i virusinfektioner.

Biokemikere mærket RNA-modifikationer kemo-enzymatisk

For at få en bedre forståelse af m6A, forskerne søgte at finde ud af, hvor nøjagtigt i mRNA'en modifikationen befandt sig. For at mærke molekyler, biologer bruger ofte antistoffer, der knytter sig til det. Denne metode har sine begrænsninger, imidlertid; antistofferne kan binde ikke kun til modifikationerne af mRNA, men også til naboeukleotider. Dette gør det svært at lokalisere ændringerne præcist. "Vi ønskede nu at udføre mærkningen med en kemisk tilgang, "Forklarer Andrea Rentmeister. For første gang, hun og hendes team brugte propargylgrupper, en lidt længere carbonhydridrest.

Forskerne koblede propargylgrupperne til cosubstratet af enzymet, og kombinerede alle tre komponenter med mRNA -molekyler i reagensglasset. I sin kemiske struktur, propargyl ligner et naturligt molekyle bundet af en methyltransferase. Methyltransferaser for deres del er enzymer, der er ansvarlige for modifikationen af ​​mRNA. Dermed, methyltransferaserne var i stand til at overføre propargylgruppen til RNA. Ved hjælp af såkaldt klikkemi, forskerne var i stand til at isolere og rense RNA'et med propargylgrupper.

Molekylære biologer opdagede RNA -ændringer ved hjælp af Next Generation Sequencing

For at opdage de specifikt mærkede ændringer, forskerne brugte et specielt enzym til at transskribere mRNA tilbage til DNA. Den resulterende DNA -streng er en kopi af det tidligere RNA og kan undersøges ved hjælp af molekylærbiologiske metoder. Forskerne sekventerede denne nyligt syntetiserede DNA -streng, læse sekvenserne af nukleotider. De brugte næste generations sekventering, hvilket gjorde dem i stand til at bestemme sekvenserne af nukleotider ekstremt effektivt. "Denne metode giver os mulighed for at analysere tusindvis af sekvenser parallelt, ”forklarer Sebastian Leidel.

Fordi forskerne havde mærket modifikationerne med propargylgrupperne, de enzymer, der er nødvendige for omskrivning af det RNA, der blev standset. Som resultat, de undlod at transskribere RNA'et tilbage til DNA. "Enzymerne ophørte med enhver aktivitet på de mærkede steder og genererede en slags stopsignal, "siger Katja Hartstock, en kemiker og hovedforfatter af historien. Forskerne var i stand til at bestemme disse stopsignaler under sekventeringen, hvilket betød, at de kunne detektere de steder, hvor mRNA -modifikationen fandt sted.

Efter de første forsøg i reagensglas, forskerne anvendte deres nye metode i en kultur af humane epitelceller - HeLa -celler. Forskerne fodrede cellerne med en propargylmærket såkaldt aminosyreforløber, som cellerne "spiste, "og begyndte efterfølgende at mærke. Som allerede fastslået i reagensglasset, propargylgrupperne knyttet sig til RNA ved hjælp af methyltransferaser og tillod detektion af mRNA -modifikationssteder ved næste generations sekventering.

Det næste skridt forskerne vil tage er at anvende deres metode på levende organismer for at studere betydningen af ​​modifikationen inden for deres udvikling. Zebrafisk er velegnede til dette formål, da de udvikler sig meget hurtigt, og modifikationerne derfor transkriberes hurtigere - og fjernes også hurtigere igen.