Forbedret osteogen aktivitet af præ-osteoblaster på overflademodificerede 3-D printede stilladser

Materialer såsom poly(ε-caprolacton) bruges som stilladser i knoglevævsteknik, men deres iboende hydrofobicitet og overfladeglathed kan forringe cellevedhæftning, spredning og differentiering i laboratoriet, eller efter implantation in vivo. Overflademodifikationer inklusive kemiske ændringer eller immobilisering af biologisk aktive molekyler på materialer kan overvinde den iboende hydrofobicitet af poly(ε-caprolacton) (PCL). I en nylig undersøgelse, bioingeniører Yasaman Zamani og hendes kolleger undersøgte en kemisk modificeret, 3-D printet PCL materiale overflade immobiliseret med RGD peptid (R:arginin, G:glycin, D:asparaginsyre). Resultaterne af undersøgelsen er offentliggjort på Biomedicinske materialer , IOP-udgivelse.

Store knogledefekter forårsaget af traumer eller tumorresektion kan ofte ikke heles via den naturlige proces med knogleregenerering. Den eksisterende guldstandard for klinisk behandling af sådanne defekter er autolog knogletransplantation; hvor knoglevæv høstet fra den samme patient på et andet kirurgisk sted er implanteret på stedet for skade eller defekt. Autograft -teknikken er dårligt stillet på grund af begrænset udbud, behovet for flere operationer, patientens aldersrelaterede immunkompromis og forlængede helingstid. Som resultat, knoglevævsteknik (BTE) er hurtigt ved at blive et lovende alternativ, der eliminerer behovet for yderligere operationer. Af design, BTE skaber et stillads for midlertidigt at erstatte den ekstracellulære matrix, der omgiver defektstedet for at hjælpe vævsregenerering og knoglereparation i en bestemt tidslinje. Første generations teknikker til BTE kan ikke kontrollere porøsiteten, mikroarkitektur og geometri af stilladser. Tredimensionel (3-D) udskrivning er almindeligt anvendt i øjeblikket til at konstruere stilladser til vævsteknologi med kontrolleret form og arkitektur.

Den mest udbredte polymer til 3D-udskrivning af knoglestilladser er PCL, på grund af dens lave smelte- og glasovergangstemperatur for nem behandling. Polymererne har fremragende mekanisk karakter velegnet til knogleudskiftningsstilladser og er godkendt af US Food and Drug Administration. Imidlertid, til celle-seeding-applikationer i BTE, 3-D-printede PCL-polymerer kræver overflademodifikation, da den iboende hydrofobicitet og manglen på overfladebundne biologiske genkendelsessteder begrænser overfladebiokompatibiliteten. En række eksisterende BTE -overflademodifikationsteknikker implementeres derfor som fysiske, kemiske og biologiske metoder. For eksempel, hydrolyse af PCL med natriumhydroxid (NaOH) er en kemisk teknik, der kan øge hydrofilicitet (vandelskende natur) af PCL ved at skabe overfladecarboxyl- og hydroxylgrupper for forbedret cellevedhæftning.

Immobilisering af RGD-peptid på PCL-overflader kunne også hjælpe celler med at binde og vokse på modificerede overflader. I dette tilfælde, cellematerialet vedhæftning blev tilskrevet integriner; en gruppe celleoverfladeproteiner, der medierer cellebinding til specifikke adhæsionsmolekyler og derved genkender RGD -sekvensen på en substratoverflade. Mens virkningerne af overflademodifikation på biomaterialeegenskaber og cellulære responser blev grundigt undersøgt, resultaterne gælder ikke for alle typer stilladser. Mest vigtigt, eksperimenter mangler stadig at blive udført for at forstå, hvilke af disse overflademodifikationer, der er mere effektive til præ-osteoblastcelleproliferation og osteogen aktivitet på et 3-D printet stillads. Zamani et al. undersøgte derfor 3-D printede PCL-stilladsoverflader modificeret ved alkalibehandling med NaOH eller ved RGD-immobilisering for at forstå cellulær respons på materialekonstruktionen.

I undersøgelsen, forskerne udførte biofunktionaliseringseksperimenter med murine calvariae præ-osteoblaster (MC3T3-E1) for at vurdere den osteogene respons på modificerede 3-D overflader for BTE. Kemisk overflademodifikation blev udført under anvendelse af NaOH-behandling i 24 timer eller 72 timer (3M koncentration), som ændrede overfladetopografien fra en glat overflade til en bikage-lignende struktur. Til RGD-immobilisering, overflader blev inkuberet med 600 µl RGD (0,125 mg/ml). Kort om, i en tidsramme på 1-14 dages cellekultur, øget kollagen matrixaflejring blev observeret på de NaOH-behandlede og RGD-immobiliserede stilladser sammenlignet med de ikke-modificerede kontroller. De kemisk modificerede overflader viste øget alkalisk fosfataseaktivitet, afgørende for knogleudvikling. Forskerne bemærkede, at overflader behandlet med NaOH for en optimal 24 timers forbedret mineralisering sammenlignet med de ikke-modificerede kontroller.

Forskerne brugte en 3-D Discovery ^TM bioprinter til at printe stilladserne. Det medicinske PCL-materiale blev smeltet i varmetanken og forlænget gennem en forvarmet nål, strengene af PCL blev plottet lag for lag for at skabe 36 kubiske stilladser. De forskellige PCL-stilladser med og uden overflademodifikationer blev karakteriseret ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Cellekultur blev udført med MC3T3-E1 præ-osteoblaster på de forskellige materialer af interesse for at observere og kvantificere parametre for celleproliferation, differentiering, kollagen-matrix aflejring, alkalisk fosfataseaktivitet og calciumaflejring fra 1-14 dage. Både 24-timers og 72-timers NaOH-behandlede overflader viste en honeycomb-lignende overfladetopografi, men RGD-immobilisering ændrede ikke på samme måde overfladetopografien. De dyrkede præ-osteoblaster var let sfæriske på de umodificerede PCL-stilladser, hvilket indikerer overfladehydrofobicitet, til sammenligning var cellerne spredt godt på de 24-timers NaOH-behandlede og RGD-immobiliserede stilladser på grund af overfladehydrofilicitet og celleoverfladegenkendelse.

Kollagenaflejring på de modificerede/umodificerede overflader dyrket med celler blev observeret med picrosiriusrød farvning ved anvendelse af lysmikroskopi på dag 14. Den kvantificerede røde intensitet var større for 24-timers NaOH-behandlede og RGD-immobiliserede stilladser sammenlignet med kontrollerne. Derudover sammenlignet med NaOH-stilladserne viste de RGD-modificerede overflader signifikant højere kollagenaflejring. Calciumaflejring blev observeret med alizarin rødfarvede stilladskonstruktioner ved anvendelse af optiske billeder. Mere rød plet blev observeret på NaOH -behandlede stilladser for at indikere forholdsvis mere calciumaflejring. Tilsvarende ALP-aktiviteten var forholdsvis højest på de 24-timers NaOH-behandlede stilladser. Interessant nok, NaOH -behandling i 72 timer øgede ikke ALP -aktiviteten sammenlignet med de umodificerede kontroller.

Baseret på de første resultater, parametrene for overflademodifikation blev forfinet i undersøgelsen til at omfatte optimal RGD-immobilisering (0,011 µg/ml stillads) og 24-timers NaOH-behandling til kemisk konstruktion af 3D-trykte PCL-stilladser. Undersøgelsen viste samlet forbedret osteogen differentiering på 24-timers NaOH-behandlede stilladser sammenlignet med RGD-immobiliserede stilladser in vitro. Resultaterne antydede, at kemisk behandling af 3-D PCL-stilladser ved hjælp af 3M NaOH kan være mere lovende for in vivo knogleregenereringsundersøgelser sammenlignet med RGD-immobilisering, derfor. Overflademodifikation på grund af introduktionen af ​​funktionelle hydroxyl- og carboxylgrupper via NaOH-behandling øgede hydrofilicitet og biokompatibilitet. På den anden side, immobilisering af RGD på PCL lettede cellevedhæftning og -proliferation på grund af cellegenkendelsessteder, hvilket indikerer, at begge betingelser oprindeligt var gunstige for præ-osteoblastbinding og proliferation in vitro.

Længere nedsænkning under NaOH-behandling (72 timer) var ikke gunstig, da øget overfladeforringelse førte til højere mikroskala-ruhed, der forhindrede tilstrækkelige celle-celle- og/eller celle-matrix-interaktioner. Resultaterne indikerede, at tidsskalaen for at opnå optimal overfladetopologi (overfladeruhed og stivhed i dette tilfælde) til direkte osteogen differentiering var 24 timers NaOH-behandling. Cytokompatibilitet blev gentaget med ALP-aktivitet og calciumaflejringsundersøgelser for at vise forbedret osteogen differentiering på 24-timers NaOH-behandlede stilladser sammenlignet med andre grupper, angiver deres egnethed til yderligere undersøgelser i knogledannelse med osteogene celler.

På denne måde gennem omfattende eksperimenter, Zamani et al viste, at 24-timers NaOH-behandlede 3D-konstruktioner øgede præ-osteoblastproliferation og matrixaflejring sammen med øget osteogen aktivitet i BTE. Undersøgelsen demonstrerede potentialet af den optimerede materiale-overflade modifikation til at fremme knogledannelse i laboratoriet ved at lette væksten og differentieringen af ​​osteogene celler.

© 2018 Science X Network