Udarbejdelse af protokoller til fremstilling af deutererede biomolekyler

Neutronteknikker er gode til at studere lette atomer som brint - fantastisk til biologiske molekyler, der indeholder et stort antal af dem. Neutroner er særligt følsomme over for isotopisk substitution af hydrogen (1H) med deuterium (2H), og dette gør det muligt at bruge kontrastteknikker til at studere molekyler i detaljer. For det, brugere skal udarbejde deutererede versioner af de biologiske molekyler, som de vil studere. Imidlertid, disse per-deutererede molekyler er sjældent tilgængelige fra kommercielle leverandører, fordi markedet for dem er af begrænset værdi. Her har SINE2020 til formål at udfylde hullet.

Opgave 5.2 i arbejdspakken for kemisk deuterering er at opsætte procedurer for ekstraktion, oprensning og analyse af små deutererede biomolekyler. Disse molekyler vil derefter være tilgængelige for brugere af neutronteknikker og via DEUNET -platformens partnere. De vigtigste involverede biomolekyler er fosfolipider, steroler (f.eks. kolesterol) og sphingolipider - alle typer molekyler, der kan findes i biologiske membraner og derfor har vigtige anvendelser inden for lægemidler. Lipider har også roller i kosmetik, fødevare- og nanoteknologisektorer, så muligheden for at studere dem ved hjælp af neutroner ville være uvurderlig for mange forskere og industrielle virksomheder.

Krishna Batchu, med Giovanna Fragneto, på ILL udfører forskningen for SINE2020. Arbejdet har koncentreret sig om forskellige fosfolipider, der hovedsageligt omfatter phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylcholin (PC) og phosphatidylserin (PS). De fremstilles ved hjælp af cellekulturer af gærstammen Pichia pastoris, da den fungerer godt til lipidekstraktion og vokser med succes i deutererede medier.

Fosfolipider er amfipatiske molekyler, der består af en vandelskende hovedgruppe og to vandhadende "ben". "Benene" er kæder af carbonatomer, der er knyttet til hydrogen (eller deuteriumatomer). Deres sammensætninger i cellemembranerne er enormt komplekse med membraner, der typisk omfatter flere tusinde kemisk forskellige molekylære lipider. Kæderne indenfor kan variere i længde, normalt mellem 6 og 24 carbonatomer, og indeholder mellem 0 og 12 dobbeltbindinger mellem carbonatomerne-det såkaldte mætningsniveau. Jo flere dobbeltbindinger, jo mere umættet kæden.

Phospholipid homeostase i et biologisk system opretholdes via tre centrale cellulære processer:1) Biosyntese 2) Remodeling og 3) Degradation. I gærcellerne (i kulturen) findes et dedikeret molekylært maskineri til fedtsyremetabolisme, der forårsager både forlængelse og umættethed af kæden, katalyseret af henholdsvis elongaser og desaturaser, under produktionsprocessen. Når biosyntetiseret, deres inkorporering i forskellige phospholipider katalyseres af et antal acyltransferaser, hvilket således fører til eksistensen af ​​et større repertoire af individuelle molekylære arter. Udfordringen er, at med så mange variabler er antallet af producerede phospholipider stort.

En del af projektet har undersøgt, hvordan vækstbetingelser påvirker typen af ​​producerede lipider. Der er ikke fundet signifikante forskelle, der tyder på, at høsttid påvirker lipidprofilen, men der er noget, der tyder på, at kulkilden har en effekt, og at der opstår mere umættethed, hvis der opstår vækst ved lavere temperaturer.

Når en cellekultur er vokset, lipiderne skal ekstraheres, adskilt og renset. Dette er opnået, til både hydrogeneret og deutereret pc, PS- og PE -molekyler, ved hjælp af en totrinsproces:en ekstraktion i fast fase efterfulgt af oprensning via en normalfasesøjle koblet til et HPLC-system. Hydrogenerede versioner er blevet udarbejdet for at sammenligne dem med deutererede arter og til indledende testprocesser for at undgå at spilde dyrt deuterium.

Nu er udfordringen at rense individuelle molekylære arter, identificere dem og analysere dem ved hjælp af en massespektrometrisk tilgang. Det ultimative mål er omhyggeligt at dokumentere alle procedurer og protokoller til fremstilling af disse deutererede biomolekyler til fremtidige brugere.