For CRISPR, justering af DNA-fragmenter før indsættelse giver de højeste effektivitetsrater endnu

Forskere fra University of Illinois opnåede den højeste rapporterede frekvens for indsættelse af gener i menneskelige celler med CRISPR-Cas9-genredigeringssystemet, et nødvendigt skridt for at udnytte CRISPR til kliniske genterapiapplikationer.

Ved kemisk at justere enderne af det DNA, der skal indsættes, den nye teknik er op til fem gange mere effektiv end de nuværende metoder. Forskerne så forbedringer på forskellige genetiske steder testet i en human nyrecellelinje, endda se 65% indsættelse på et sted, hvor den tidligere højde havde været 15%.

Ledet af professor i kemisk og biomolekylær ingeniør Huimin Zhao, forskerne publicerede deres arbejde i tidsskriftet Naturens kemiske biologi .

Forskere har fundet ud af, at CRISPR er et effektivt værktøj til at slukke, eller "slå ud, "et gen. Men i menneskelige celler, det har ikke været en særlig effektiv måde at indsætte eller "banke i" et gen.

"En god knock-in metode er vigtig for både genterapiapplikationer og for grundlæggende biologisk forskning for at studere genfunktion, "sagde Zhao, der leder biosystemdesign-temaet på Carl R. Woese Institute for Genomic Biology i Illinois. "Med en knock-in metode, vi kan tilføje en etiket til ethvert gen, studere dens funktion og se, hvordan genekspression påvirkes af kræft eller ændringer i kromosomstrukturen. Eller til genterapiapplikationer, hvis nogen har en sygdom forårsaget af et manglende gen, vi vil gerne kunne indsætte det."

Søger efter en måde at øge effektiviteten, Zhaos gruppe kiggede på 13 forskellige måder at ændre det indsatte DNA på. De fandt ud af, at små ændringer i slutningen af ​​DNA'et øgede både hastigheden og effektiviteten af ​​indsættelsen.

Derefter, forskerne testede at indsætte slutmodificerede DNA-fragmenter af varierende størrelse på flere punkter i genomet, ved hjælp af CRISPR-Cas9 til præcist at målrette specifikke steder til indsættelse. De fandt effektiviteten forbedret to til fem gange, selv når man indsætter større DNA-fragmenter - den sværeste indsættelse at lave.

"Vi spekulerer i, at effektiviteten blev forbedret så meget, fordi den kemiske modifikation til slutningen stabiliserer det DNA, vi indsætter, "Sagde Zhao." Normalt når du forsøger at overføre DNA ind i cellen, det bliver nedbrudt af enzymer, der tærer på det fra enderne. Vi tror, ​​at vores kemiske tilsætning beskytter enderne. Mere DNA kommer ind i kernen, og at DNA er mere stabilt, så det er derfor, jeg tror, ​​det har en større chance for at blive integreret i kromosomet."

Zhaos gruppe bruger allerede metoden til at mærke essentielle gener i genfunktionsundersøgelser. De brugte bevidst hyldekemikalier til at modificere DNA-fragmenterne, så andre forskerhold kunne bruge den samme metode til deres egne genetiske undersøgelser.

"Vi har udviklet en del knock-in metoder tidligere, men vi har aldrig tænkt på bare at bruge kemikalier til at øge stabiliteten af ​​det DNA, vi vil indsætte, " sagde Zhao. "Det er en simpel strategi, men det virker."