Nanopore afslører formskiftende enzym forbundet med katalyse

University of Groningen forskere har observeret egenskaberne ved et enkelt enzym inde i en nanopore. De lærte, at enzymet kan eksistere i fire forskellige foldede tilstande, eller konformere, der spiller en aktiv rolle i reaktionsmekanismen. Disse resultater vil have konsekvenser for enzymteknik og udvikling af inhibitorer. Undersøgelsen blev offentliggjort i Naturkemi den 6. april.

Enzymer er foldede proteiner, der har en specifik tredimensionel struktur, der skaber et aktivt sted, der kan binde et substrat og katalysere en specifik reaktion. I de seneste år, det er blevet klart, at enzymer ikke er stive strukturer, men at de foldede proteiner eksisterer som et ensemble af konformationer i ligevægt omkring en energisk stabil grundtilstand.

Vindtunnel

At studere overgangen mellem stater kræver observation af enkelte enzymer i en længere periode, hvilket er udfordrende. University of Groningen Lektor i kemisk biologi Giovanni Maglia udviklede tragtformede nanoporer, der kan fange proteiner. Ved at måle ionstrømmen over en sådan nanopore indlejret i en kunstig lipidmembran, Maglia var i stand til at observere konformationsændringer i enzymer. "Du kan sammenligne det med at studere en bil i en vindtunnel, "forklarer han." Åbning af et vindue eller en dør ændrer luftstrømmen. På lignende måde, en ændring i enzymets foldestruktur ændrer ionstrømmen gennem poren. "

Maglia brugte sit nanoporesystem til at undersøge enzymet dihydrofolatreduktase (DHFR), som omdanner dihydrofolat til tetrahydrofolat. "Vi valgte dette enzym, fordi det er blevet undersøgt som et modelsystem for enzymdynamik i over 30 år, ved hjælp af alle tilgængelige teknikker. Ud over, hæmmere af dette enzym, såsom methotrexat, bruges som kræftbekæmpende medicin.

Effektiv frigivelse

Målinger af DHFR afslørede tilstedeværelsen af ​​fire konformere med forskellige affiniteter for substraterne. Maglia siger, "Skiftet mellem disse fire tilstande var meget langsomt. Det betyder, at du kun kan se dem i den slags langvarige enkeltenzymundersøgelser."

Tilsætning af reaktionshæmmer methotrexat, som binder sig til enzymet, forårsagede en meget hurtig overgang mellem tilstande og ændrede enzymers affinitet. "Vores konklusion er, at enzymets reaktioner med forskellige forbindelser giver den frie energi til konformationsændringer, ”siger Maglia.

Desuden, konformationsændring ændrede også enzymernes affinitet. Dette giver mening, da enzymet skal binde to substrater og, efter afslutning af reaktionen, skal frigive begge. "Substratet og produktet er meget ens molekyler, så enzymet skal ændre sin affinitet for en effektiv frigivelse. "

To stater

Baseret på disse undersøgelser, Maglia kan se enzymet skifte mellem to tilstande:Efter binding af substratet, NADPH driver reaktionen, som derefter ændrer enzymets konformation og derved dets affinitet. Efterfølgende, binding af et nyt substrat bringer det tilbage til den første tilstand. "Dette forklarer to af de fire konformere, som vi observerede; vi kan endnu ikke give mening om de to andre, "Siger Maglia. Det er umuligt at udlede strukturelle oplysninger fra målingerne.

Alligevel, undersøgelsen viser kraften i nanopore -teknologi til at bestemme de strukturelle ændringer af enzymer. "Vi ved også nu, at dette enzym har fire forskellige jordtilstande og skal skifte mellem dem for at fungere." Dette tilføjer en udfordring til enzymdesign:Ikke alene bør dette producere et reaktivt center, men det bør også tillade de nødvendige konformationsændringer. Maglia:"Dette kan forklare, hvorfor kunstigt designede enzymer ofte ikke fungerer så effektivt som naturlige enzymer." Endelig, undersøgelsen vil også give forskere mulighed for at identificere nye hæmmende lægemidler, der binder tættere til DHFR end methotrexat.