Tyrosin-chassis til bæredygtig, højtydende produktion af nyttige forbindelser i smarte gærceller

Kobe University-forskere har med succes udviklet et tyrosin-chassis (en stamme af mikroorganismer med høj tyrosinproduktivitet) i gæren Pichia pastoris gennem rationel konstruktion. Derudover brugte de dette tyrosin-chassis til at udvikle smarte celler, der kan producere de plante-afledte forbindelser henholdsvis resveratrol, naringenin, norcoclaurin og reticulin. Disse forbindelser har en bred vifte af anvendelser; f.eks. bruges de til at tilføje næring til fødevarer og som råvarer til medicin. Det er håbet, at dette tyrosin-chassis kan bruges som udgangspunkt for højtydende biosyntese af forskellige nyttige forbindelser og generiske kemikalier.

Denne undersøgelse fra Kobe University blev udført af en forskergruppe, der omfattede Ph.D. studerende Kumokita Ryota (Graduate School of Science, Technology and Innovation) og professor Hasunuma Tomohisa (Engineering Biology Research Center).

Disse forskningsresultater blev offentliggjort i det internationale videnskabelige tidsskrift ACS Synthetic Biology den 16. maj 2022.

Bioaktive plante-afledte aromatiske forbindelser såsom stilbenoider, flavonoider og benzylisoquinolinalkaloider (BIA) fremstilles ud fra tyrosin. Disse forbindelser har en bred vifte af anvendelser på tværs af mange industrier, herunder kemisk produktion, fødevare-, kosmetik- og farmaceutiske industrier. Disse aromatiske forbindelser fremstilles i dag ved direkte udvinding fra planter, men der findes kun små mængder inde i planter, og udbyttet afhænger i høj grad af vejr og klima. Der er ikke en stabil forsyning.

I de senere år har fremskridt inden for syntetisk biologi ført til udviklingen af ​​teknikker til fremstilling af nyttige forbindelser. Disse teknikker drager fordel af mikroorganismers evne til at producere stoffer ved at indføre plante-afledte metaboliske veje i mikroorganismen, så den vil producere målforbindelsen. Af mikroorganismerne har gær fået opmærksomhed som vært for sammensætningsproduktion, fordi de udmærker sig ved at biosyntetisere planteafledte forbindelser. Gærs potentiale til at producere tyrosin-afledte forbindelser var imidlertid uklart, da der var rapporteret få succeser.

I denne undersøgelse begyndte forskerne med at skabe en gærstamme, der kunne producere høje udbytter af tyrosin. Ved at bruge denne nye stamme som udgangspunkt foretog de ændringer i dens metabolisme for at nå det førnævnte mål om at producere høje udbytter af forskellige nyttige forbindelser. Den type gær, de fokuserede på, var P. pastoris. P. pastoris formerer sig hurtigt under aerobe forhold og producerer ikke fermentative biprodukter (ethanol), hvilket betyder, at det har potentialet til at producere høje udbytter af en målforbindelse på kort tid. Imidlertid havde ingen undersøgelser rapporteret om produktion af tyrosin-afledte forbindelser i P. pastoris, og det var ikke kendt, hvilke gener der ville være nyttige til at producere høje udbytter. Mens de udførte en simpel evaluering af mængden af ​​produceret tyrosin, ledte forskerne også efter gener, der forbedrer tyrosinproduktionen. De evaluerede derefter P. pastoris' potentiale for biosyntetisering af tyrosin-afledte nyttige forbindelser ved at introducere biosynteseveje i gæren for hver af følgende:stilbenoiden resveratrol, flavonoiden naringenin og BIA'erne norcoclaurin og reticulin.

Først og fremmest satte forskerne sig for at finde gener i gærstammer, der øger produktionen af ​​tyrosin. For at gøre dette fokuserede de på betaxanthin, som kan fremstilles ud fra tyrosin i en 3-trins reaktion (figur 1).

Betaxanthin er et gult pigment, der udsender grøn fluorescens. Derfor er det let at vurdere styrken af ​​den metaboliske flux til tyrosin ved at se på fluorescensintensiteten og farven. Ved at skabe denne evalueringsmetode opdagede forskerne gener, der forbedrede tyrosinproduktiviteten og brugte denne viden til med succes at udvikle en stamme af P. pastoris med høj tyrosinproduktivitet (figur 2).

Forskernes næste mål var at forbedre produktionshastigheden af ​​forskellige nyttige tyrosin-afledte forbindelser ved at ændre metabolismen af ​​den højproduktive stamme. Det lykkedes dem i høj grad at forbedre produktionen af ​​resveratrol, naringenin og norcoclaurin ved at introducere specifikke biosynteseveje (Figur 1) for hver enkelt, hvilket afslørede, at P. pastoris kan producere høje udbytter af tyrosin-afledte forbindelser (Figur 3).

Efterfølgende analyserede forskergruppen de intracellulære metabolitter i den nye P. pastoris-stamme, som de udviklede, og undersøgte mekanismen for høj tyrosinproduktivitet. Resultaterne afslørede, at et stort antal shikimat-pathway-metabolitter involveret i tyrosin- og tyrosinsyntese akkumulerede i den konstruerede stamme (figur 4). Disse resultater viser, at ændring af metabolismen med succes forbedrede den metaboliske flux til tyrosin. Der er fremtidigt potentiale for yderligere at øge produktionen af ​​nyttige forbindelser, der kan biosyntetiseres fra tyrosin ved at optimere metabolismen af ​​shikimat-vejen.

Endelig sigtede forskerne på at producere tyrosin-afledte forbindelser via fermentering med rå glycerol som vækstmedium. Råglycerol er et væsentligt affaldsbiprodukt fra produktion af biodiesel (et potentielt alternativ til petrokemisk brændstof). Forskergruppen brugte væsken (figur 5, højre) opnået ved at neutralisere rå glycerol som et vækstmedium i et mikrobielt produktionseksperiment. I dette forsøg lykkedes det dem at producere de samme mængder af resveratrol, naringenin og norcoclaurin, som når man brugte ren glycerol. Disse resultater viser, at P. pastoris ikke kun kan producere nyttige forbindelser ud fra ren glycerol, men også fra rå glycerol.

Tyrosin-chassiset udviklet gennem denne forskning kan anvendes til fermentativ produktion af forskellige nyttige forbindelser og generiske kemikalier, der kan biosyntetiseres fra tyrosin. Derudover håber forskerne at øge produktionen af ​​tyrosin-afledte forbindelser yderligere ved at bruge resultaterne af metabolomanalysen af ​​deres nye P. pastoris-stamme som grundlag for optimering af metaboliske veje. + Udforsk yderligere

Opdagelse af nyt fænomen en game-changer for effektiv bioproduktion af nyttige kemikalier