Komponenter i Lysisbuffere

Lyse er et ord, der kommer fra græsk og blot betyder "at splitte" eller "at sprænge." Helt korrekt angår udtrykkene hvad der sker med celler i en lysebuffer, en løsning, der bryder dem åbne for udtræk deres indhold. Forskere bruger lysebuffere, når de ekstraherer DNA eller proteiner fra celler til analyse, især i tilfælde af bakterier. Typen af cellelysebuffer varierer afhængigt af typen af eksperiment, selvom følgende er nogle almindelige valg.

TL; DR (for lang; læste ikke)

Lysepuffere hjælper med at bryde åbne celler, så deres indhold kan åbnes eller fjernes. Nogle eksempler inkluderer salte, detergenter, chelateringsmidler og hæmmere og nogle alkaliske kemikalier.
Buffer og salt

Buffere stabiliserer pH, mens cellerne splittes. Tris-HCL er et af de mest almindelige kemikalier til buffering ved pH 8. HEPES er et andet almindeligt bufferkemikalie i disse eksperimenter. Natriumchloridsalt kan også øge ionstyrken, den samlede koncentration af opløste stoffer uden for cellerne. Dette sidste punkt har en vis betydning, da vand kan diffundere på tværs af cellemembraner fra regioner med lav opløst koncentration til regioner med høj opløst koncentration.
Opløsning Detergenter

Detergenter opløser cellemembraner, så celleindholdet kan undslippe. Har og den amfipatiske molekylstruktur (dvs. molekyler med den ene ende, der let interagerer med vandmolekyler, mens den anden hydrofobe eller "vand frygtende" ende ikke gør det). De kan opløse fedt ved at danne miceller, små klynger, hvor det hydrofobe haler i detergentmolekylerne peger indad mod fedtmolekylerne. Almindelige detergenter inkluderer natriumdodecylsulfat eller SDS, NP-40 og tritonX.
Chelateringsmidler og hæmmere.

Lysebuffere inkluderer typisk også chelateringsmidler som ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) eller ethylenglycol-tetraeddikesyre (EGTA) ). Disse kemikalier binder til metalioner med to positive ladninger (f.eks. Magnesium og calcium), hvilket gør dem utilgængelige for andre reaktioner. Mange DNA-proteiner (proteiner, der tygger op DNA) og proteaser (proteiner, der opskærer andre proteiner) har brug for magnesiumioner for at fungere, så ved at fratage dem denne nøgleingrediens hjælper EDTA og EGTA med at reducere niveauet af protease eller DNAse-aktivitet. De udelukker dog ikke det helt, og nogle proteaser afhænger ikke af magnesiumsofaktorer, så lysepuffere inkluderer undertiden også kemikalier kaldet proteaseinhibitorer, som binder til proteaser og forhindrer dem i at fungere korrekt.
Alkaline Lysis

Alkalisk lysis, en meget almindelig teknik til oprensning af plasmider fra bakterier, involverer tre opløsninger. Den første indeholder glukose, tris-HCL-buffer, EDTA og RNA. Glukosen skaber en høj koncentration af opløst stof uden for bakterierne, så de bliver lidt slappe, hvilket gør dem lettere at lysere. EDTA og tris-HCL fungerer som allerede beskrevet, mens RNAse tygger op ethvert RNA inde i cellen for at få det ud af vejen. Den anden opløsning lyserer faktisk cellerne. Denne indeholder SDS-detergent og NaOH, som hæver pH til 12 eller derover, denaturerer proteiner inde i cellen og får DNA til at adskilles i enkeltstrenge. Den tredje opløsning indeholder kaliumacetat for at gendanne pH til et mere neutralt niveau, så plasmid-DNA-strengene kan komme sammen igen. I mellemtiden klumper de denaturerede proteiner sig sammen og udfældes, mens dodecylsulfationerne kommer sammen med kaliumionerne til dannelse af en uopløselig forbindelse, som også udfælder fra opløsningen.