Beregning af omsætningstallet (k_cat ) for et enzym

Af Andy Pasquesi
Opdateret 30. august 2022

Enzymer accelererer kemiske reaktioner ved at sænke den aktiveringsenergi, der kræves til substratomdannelse. Omsætningstallet, k_cat , kvantificerer den katalytiske effektivitet af et enzym ved at måle antallet af substratmolekyler omdannet til produkt pr. enzymaktivt sted pr. sekund under mættende substratbetingelser.

1. Bestemmelse af indledende reaktionshastigheder

Trin 1

Tegn produktkoncentrationen i forhold til tiden for det første reagensglas i dit enzymatiske assay. Brug tid på den vandrette akse og produktkoncentration på den lodrette akse.

Trin 2

Beregn hældningen af den lineære del af kurven (starthastighed, V₀ ). I Excel eller en grafregner vil den lineære regressionslinje give dig hældningen direkte. Hvis du foretrækker et manuelt estimat, skal du dividere ændringen i produktkoncentration mellem to på hinanden følgende datapunkter med den tilsvarende ændring i tid.

Trin 3

Optag denne hældning som den indledende reaktionshastighed, V₀ , for det reagensglas. I regressionsligningen [Product] = m·time + b , koefficienten m er V₀ .

Trin 4

Gentag trin 1-3 for hvert reagensglas i analysen for at opnå en serie af V₀ værdier ved forskellige substratkoncentrationer.

2. Beregning af V_max Brug af Lineweaver–Burk-plottet

Trin 1

Opret et Lineweaver-Burk (dobbelt-gensidigt) plot:plot 1/[S] (omvendt substratkoncentration) på den vandrette akse og 1/V0 (invers begyndelseshastighed) på den lodrette akse. For eksempel, hvis et reagensglas har en initial substratkoncentration på 50 µM og en V₀ på 80 µMs ^–1 , ville det plottede punkt være (1/50 µM, 1/80 µMs ^–1 ).

Trin 2

Udfør en lineær regression på disse punkter. Den resulterende ligning har formen 1/V0 = m·(1/[S]) + b , hvor b er y-skæringspunktet.

Trin 3

Beregn det inverse af V_max ved at tage den reciproke af y-afsnittet:1/Vmax = 1/b .

Trin 4

Inverter værdien fra trin 3 for at opnå V_max :

Vmax = 1/(1/Vmax) = b

Trin 5

Identificer den enzymkoncentration, der bruges i analysen (denne værdi er konstant på tværs af alle reagensglas og bør rapporteres i rådataene).

Trin 6

Beregn k_cat ved at dividere V_max ved enzymkoncentrationen:

kcat = Vmax / [E]

Dette giver antallet af substratmolekyler konverteret pr. enzymaktivt sted pr. sekund.

Nøgletilbehør

Ved at følge disse systematiske trin - måling af begyndelseshastigheder, konstruering af et Lineweaver-Burk-plot, udtrækning af V_max , og normalisere til enzymkoncentration - du kan nøjagtigt bestemme et enzyms omsætningstal, k_cat , en hjørnestensmetrik i enzymologi og lægemiddeludvikling.