Under elektronmikroskopet-Et 3D-billede af et individuelt protein

(PhysOrg.com)-Når Gang Ren hvirvler kontrollerne i sit kryo-elektronmikroskop, han sammenligner det med at finjustere gearskift og bremser på en racercykel. Men denne maskine ved US Department of Energy (DOE) s Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) er lidt mere kompleks. Det koster næsten 1,5 millioner dollars, fungerer ved den kølige temperatur af flydende nitrogen, og det giver forskere mulighed for at se, hvad ingen har set før.

På Molecular Foundry, Berkeley Labs anerkendte nanoteknologiske forskningscenter, Ren har skubbet sit Zeiss Libra 120 Cryo-Tem-mikroskop til beslutninger, som aldrig havde været forestillet af dets tyske producenter, producere detaljerede øjebliksbilleder af individuelle molekyler. I dag, han og hans kollega Lei Zhang rapporterer de første 3D-billeder af et individuelt protein, der nogensinde er opnået med tilstrækkelig klarhed til at bestemme dets struktur.

Forskere skaber rutinemæssigt modeller af proteiner ved hjælp af røntgendiffraktion, nuklear magnetisk resonans, og konventionel cryo-elektronmikroskop (cryoEM) billeddannelse. Men disse modeller kræver computer "gennemsnit" af data fra analyse af tusinder, eller endda millioner af lignende molekyler, fordi det er så svært at løse egenskaberne ved en enkelt partikel. Ren og Zhang har gjort netop det, generering af detaljerede modeller ved hjælp af elektronmikroskopiske billeder af et enkelt protein.

Han kalder sin teknik for "elektron-tomografi med individuelle partikler, ”Eller IPET. Værket er beskrevet i udgaven af ​​24. januar af PLoS One , open source videnskabeligt tidsskrift, i en artikel med titlen "IPET and FETR:Experimental Approach for Study of Molecular Structure Dynamics by Cryo-Electron Tomography of a Single-Molecule Structure."

De 3D-billeder, der er rapporteret i avisen, inkluderer dem af et enkelt IgG-antistof og apolipoprotein A-1 (ApoA-1), et protein involveret i menneskelig metabolisme. Rens mål er at producere individuelle 3D-billeder af medicinsk signifikante proteiner, såsom HDL-det hjertebeskyttende "gode kolesterol", hvis struktur har unddraget sig indsats fra legioner af forskere bevæbnet med langt mere kraftfulde proteinmodelleringsværktøjer. ”Vi er godt på vej, ”Siger Ren.

Ren har legitimationsoplysninger fra en, der ved, hvad han kan gøre. Han blev rekrutteret til at arbejde på Berkeley Lab i august 2010 fra University of California i San Francisco, hvor han havde brugt et kryo-elektronmikroskop og mere konventionelle gennemsnitsteknikker til at skelne 3D-strukturen af ​​LDL-det "dårlige kolesterol" menes at være en stor risikofaktor for hjertesygdomme.

Hans billeder af enkelte proteiner er lidt uklare, selv efter at de er ryddet op ved kompleks computerfiltrering, men meget informativ for den uddannede observatør. Disse individuelle partikler er ekstraordinært små, kræver Ren at nulstille på et sted på mindre end 20 nanometer. Han har rapporteret proteinbilleder helt ned til 70 kDa. Det er kilodalton, en lilliputisk skala (udtrykt i masseenheder) afsat til måling af atomer, molekyler, og uddrag af DNA. Det er en mere nyttig måde at størrelse bløde genstande som proteiner, der kan klumpes sammen, snorlige, eller diskette.

I modsætning til de skulpturelle billeder af proteinmodeller, en række af disse fotografier kan formidle en følelse af disse partikler i al deres nanoskala diskette. Inden for disse proteiners komplekse struktur ligger hemmelighederne ved deres funktion, og måske nøgler til stoffer, der blokerer de dårlige og fremmer de gode. Med noget ekstra computerfiltrering, en højkontrastmodel af protein kan genereres fra billederne og animeres for at vise dets bevægelige dele i 3D.

“Dette giver dig mulighed for at se personligheden af ​​hvert protein, Siger Ren. "Det er et bevis på konceptet for noget, som folk troede var umuligt."

Ved at observere strukturen af ​​enkelte proteiner, det er muligt at forstå deres fleksibilitet, bevægelige dele. “Dette åbner en dør for undersøgelsen af ​​proteindynamik, ”Siger Ren. "Antistoffer, for eksempel, er ikke solide. De er meget fleksible, meget dynamisk. ”

Hvordan lokkede Ren så meget alsidighed ud af sin Vægt 120? "Det er ikke en meget avanceret model, ’Indrømmer han. Meget har at gøre med det tilbehør, han bolter fast på maskinen, og med sit eget kunstfærdighed og tålmodighed. Han har udstyret mikroskopet med en $ 300, 000 CCD kamera, nogle kraftfulde billedbehandlingssoftware, særlige kontrastmidler, og en enhed kaldet et "energifilter", der siver gennem de digitaliserede kameradata og afliver svage signaler. Grundigt fortrolig med sin tilpassede maskine, han anvender også et element af albuefedt, arbejder lange timer på at trække de kraftfulde billeder ud af en strøm af digital støj.

De flere vinkler, der bruges til at oprette 3D-portrættet, hjælper med at løse det svage molekylære billede. “Alle billeder larmer, ”Forklarer Ren. "I fysikken, støjen er inkonsekvent blandt billederne, men signalet - objektet eller proteinet - er konsistent. Ved at bruge denne tilgang, vi finder den konsistente del (signalet) kan forbedres, mens den inkonsekvente del (støjen) vil blive reduceret væsentligt. ”

Elektronmikroskoper fokuserer strømme af elektroner frem for lys for at se utroligt små ting. Den korte bølgelængde af en elektronstråle muliggør meget højere opløsning og forstørrelse end synligt lys. Kraftfulde elektronmikroskoper er blevet brugt i årtier til at undersøge materialer i atomskala; og lige ved siden af ​​Molecular Foundry er Berkeley Labs nationale center for elektronmikroskopi, som huser de mest kraftfulde mikroskoper i verden. TEAM 0.5 -mikroskopet kan skelne objekter så små som radius af et brintatom. Men disse sværvægtsmikroskoper fjerner denne atomskalaopløsning med energipulser, der ville udslette de fleste bløde biologiske proteiner. Højeffekt -elektronmikroskoper bruges primært til sondering af atomstruktur med stærke, faste materialer, såsom grafen - et gitter af kulstof, der kun er et atom tykt.

Rens laboratorium har specialiseret sig i cryoEM, som undersøger objekter, der er frosset ved -180 ° C (-292 ° F). Et bad med flydende nitrogen flash-fryser prøver så hurtigt, at der ikke dannes iskrystaller. "Det er amorft, som glas, ’, Siger Ren. Proteinprøverne er frosset på en disk på størrelse med babyens negl, fyldt med små brønde på 2 mikron på tværs. Disken indsættes i mikroskopet på en roterende støtte, der kan vippe prøven op til 140 ° inde i et vakuum-tilstrækkelige kameravinkler til at producere et 3D-perspektiv. ”Udfordringen er at isolere det fra luften, og for at vende den uden vibrationer, selv vibrationerne fra boblende flydende nitrogen, Siger Ren.

Den ekstremt lave temperatur fikser prøverne og forhindrer dem i at tørre ud i det vakuum, der er nødvendigt til elektronskanningen. Det skaber gunstige betingelser for billeddannelse ved meget lavere doser af elektroner-lavt nok til at holde et enkelt blødt protein intakt, mens mere end 100 billeder tages over en periode på en til to timer.