Billedteknologi kan låse op for mysterier om en barnesygdom

Da de var to, de fleste børn har haft respiratorisk syncytial virus (RSV) og havde symptomer ikke værre end en forkølelse. Men for nogle børn, især for tidligt fødte børn og dem med underliggende sundhedsmæssige forhold, RSV kan føre til lungebetændelse og bronkitis-hvilket kan kræve hospitalsindlæggelse og få langsigtede konsekvenser.

En ny teknik til at studere strukturen af ​​RSV -virionen og aktiviteten af ​​RSV i levende celler kan hjælpe forskere med at låse op for virusets hemmeligheder, herunder hvordan det kommer ind i celler, hvordan det replikerer, hvor mange genomer den indsætter i sine værter - og måske hvorfor visse lungeceller undslipper infektionen relativt uskadt. Det kan give forskere den information, de har brug for for at udvikle nye antivirale lægemidler og måske endda en vaccine for at forhindre alvorlige RSV -infektioner.

"Vi ønsker at udvikle værktøjer, der giver os mulighed for at finde ud af, hvordan virussen virkelig fungerer, "sagde Philip Santangelo, en lektor i Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering ved Georgia Tech og Emory University. "Vi har virkelig brug for at kunne følge infektionen i en enkelt levende celle uden at påvirke, hvordan virussen inficerer dens værter, og denne teknologi burde gøre det muligt for os. "

Forskningen blev støttet af National Institutes of Health's National Institute of General Medical Sciences og offentliggjort online forud for print i tidsskriftet ACS Nano den 30. december, 2013. Mens RSV vil være det første mål for arbejdet, forskerne mener, at den billeddannelsesteknik, de udviklede, kunne bruges til at studere andre RNA -vira, herunder influenza og ebola.

"Vi har vist, at vi kan mærke genomet ved hjælp af vores prober, "forklarede Santangelo." Det, vi har lært af dette, er, at genomet bliver inkorporeret i virionen, og at de dannede viruspartikler er smitsomme. Vi var i stand til at karakterisere nogle aspekter af selve viruspartiklen ved superopløsning, ned til 20 nanometer, ved hjælp af direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) billeddannelse. "

RSV kan være svært at studere. For én ting, den infektiøse partikel kan antage forskellige former, lige fra 10 mikron filamenter til almindelige kugler. Virussen kan indsætte mere end ét genom i værtscellerne, og RNA -orienteringen og strukturen er uorden, hvilket gør det svært at karakterisere.

Forskergruppen, som omfattede forskere fra Vanderbilt University og Emory University, brugte en sondeteknologi, der hurtigt fastgøres til RNA i cellerne. Sonden bruger flere fluoroforer til at indikere tilstedeværelsen af ​​det virale RNA, giver forskerne mulighed for at se, hvor det går i værtsceller - og se på, hvordan infektiøse partikler forlader cellerne for at sprede infektionen.

"At kunne se genomet og afkom -RNA, der kommer fra genomet med de sonder, vi bruger, giver os virkelig meget mere indsigt i replikationscyklussen, "Sagde Santangelo." Dette giver os meget mere information om, hvad virussen virkelig gør. Hvis vi kan visualisere posten, samling og replikation af virussen, det ville give os mulighed for at beslutte, hvad vi skal gå efter for at bekæmpe virussen. "

Forskningen var afhængig af en ny metode til mærkning af RNA-vira ved hjælp af multiplicerede mærkede tetravalente RNA-billedsonder (MTRIPS). Proberne består af en kimær kombination af DNA og RNA -oligonukleotid mærket internt med fluoroforer tetravelent kompleksbundet til neutravidin. Den kimære kombination blev brugt til at hjælpe proberne med at undgå cellulært forsvar.

"Der er masser af sensorer i cellen, der leder efter fremmed RNA og fremmed DNA, men til cellen, denne sonde ligner ikke noget, "Forklarer Santangelo." Cellen ser ikke nukleinsyren som fremmed. "

Indført i celler, sonderne diffunderer hurtigt gennem en celle inficeret med RSV og binder til virusets RNA. Selvom det bindes tæt, sonden påvirker ikke virusets normale aktiviteter og tillader forskere at følge aktiviteten i flere dage ved hjælp af standardmikroskopiteknikker. MTRIPS kan bruges til at supplere anden sonde -teknologi, såsom GFP og guld nanopartikler.

Arbejde udført af kandidatstuderende Eric Alonas for at koncentrere virussen var afgørende for projektet, Sagde Santangelo. Koncentrationen skulle foretages uden at det påvirker virusets infektivitet negativt, hvilket ville have påvirket dets evne til at komme ind i værtsceller.

"Det krævede en del arbejde at få de rigtige teknikker til at koncentrere RSV, "sagde han." Nu kan vi lave masser af infektiøs virus, der er mærket og kan gemmes, så vi kan bruge det, når vi vil. "

For at studere infektionens fremskridt i individuelle celler, forskerne stod over for en anden udfordring:levende celler bevæger sig rundt, og at følge dem komplicerer forskningen. For at løse denne bevægelse, Thomas Barkers laboratorium-også i Coulter-afdelingen-brugte mikro-mønstret fibronectin på glas til at skabe 50-mikron "øer", der indeholdt cellerne under undersøgelsen.

Blandt de mysterier, som forskerne gerne vil tackle, er, hvorfor visse lungeceller er alvorligt inficerede - mens andre ser ud til at slippe for dårlige virkninger.

"Hvis du ser på et felt af celler, du ser store forskelle fra celle til celle, og det er noget, man slet ikke forstår, "Sagde Santangelo." Hvis vi kan finde ud af, hvorfor nogle celler eksploderer med virus, mens andre ikke er det, måske kan vi finde ud af en måde at hjælpe de onde mere til at ligne de gode. "

Ud over de allerede nævnte, forskergruppen omfattede James Crowe, professor i pædiatri ved Vanderbilt University; Elizabeth Wright, adjunkt på School of Medicine ved Emory University; Daryll Vanover, Jeenah Jung, Chiara Zurla, Jonathan Kirschman, Vincent Fiore, og Alison Douglas fra Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering ved Georgia Tech og Emory University; Aaron Lifland og Manasa Gudheti fra Vutara Inc. i Salt Lake City, og Hong Yi fra Emory University School of Medicine.

En af udfordringerne ved at studere RSV er at opretholde sin aktivitet i laboratoriemiljøet - et problem forældre til små børn ikke deler.

"Når du håndterer denne virus i laboratoriet, du skal altid være forsigtig med, at det mister smittsomhed, "Santangelo bemærkede." Men hvis du tager et værelse fuld af børn, der ikke er blevet smittet, og lader et inficeret barn komme ind i rummet, 15 minutter senere bliver alle børn smittet. "