Forskere bruger virus til at afsløre nanopore fysik

Nanoporer kan en dag føre til en revolution inden for DNA-sekventering. Ved at glide DNA -molekyler et ad gangen gennem små huller i en tynd membran, det kan være muligt at afkode lange strækninger af DNA med lynets hastighed. Videnskabsmænd, imidlertid, har ikke helt fundet ud af fysikken i, hvordan polymertråde som DNA interagerer med nanoporer. Nu, ved hjælp af en bestemt type virus, forskere fra Brown University har kastet nyt lys over denne fysik i nanoskala.

"Det, der fik os til at interessere os for dette, var, at alle i feltet studerede DNA og udviklede modeller for, hvordan de interagerer med nanoporer, " sagde Derek Stein, lektor i fysik og teknik ved Brown, der ledede forskningen. "Men selv de mest basale ting, du ville håbe, at modeller ville forudsige ud fra de grundlæggende egenskaber ved DNA - du kunne ikke gøre det. Den eneste måde at bryde ud af det spor var at studere noget andet."

Fundene, offentliggjort i dag i Naturkommunikation , hjælper måske ikke kun med udviklingen af ​​nanopore -enheder til DNA -sekventering, de kunne også føre til en ny måde at opdage farlige patogener på.

At rette op på fysikken

Konceptet bag nanopore -sekventering er ret enkelt. Et hul på kun et par milliardtedele af en meter bredt er stukket i en membran, der adskiller to bassiner med saltvand. En elektrisk strøm tilføres systemet, som lejlighedsvis snarer en ladet DNA -streng og pisker den gennem poren - et fænomen kaldet translokation. Når et molekyle translokerer, det forårsager påviselige variationer i den elektriske strøm over poren. Ved at se nøje på disse variationer i strøm, videnskabsmænd kan være i stand til at skelne individuelle nukleotider - A'erne, C'er, G'er og T'er kodet i DNA-molekyler.

De første kommercielt tilgængelige nanopore sequencere er muligvis kun få år væk, men på trods af fremskridt på området, overraskende lidt er kendt om den grundlæggende fysik involveret, når polymerer interagerer med nanoporer. Det er dels på grund af kompleksiteten i undersøgelsen af ​​DNA. I løsning, DNA-molekyler danner kugler af tilfældige kruseduller, hvilket gør det ekstremt vanskeligt at forstå deres fysiske adfærd.

For eksempel, faktorerne, der regulerer hastigheden af ​​DNA -translokation, er ikke godt forstået. Nogle gange lyner molekyler hurtigt gennem en pore; andre gange glider de langsommere, og ingen forstår helt hvorfor.

En mulig forklaring er, at den snoede konfiguration af DNA får hvert molekyle til at opleve forskelle i modstand, når de trækkes gennem vandet mod poren. "Hvis et molekyle er krøllet op ved siden af ​​poren, den har en kortere afstand at rejse og oplever mindre luftmodstand, "sagde Angus McMullen, en fysikstuderende ved Brown og undersøgelsens hovedforfatter. "Men hvis det er strakt ud, ville det føle træk i hele længden, og det ville få det til at gå langsommere."

Træk -effekten er umulig at isolere eksperimentelt ved hjælp af DNA, men virusset McMullen og hans kolleger undersøgte tilbød en løsning.

Forskerne kiggede på fd, en harmløs virus, der inficerer e. coli bakterier. To ting gør virussen til en ideel kandidat til studier med nanporer. Først, fd-vira er alle identiske kloner af hinanden. Sekund, i modsætning til vridende DNA, fd -virus er en stiv, stavlignende molekyle. Fordi virussen ikke krøller sig sammen som DNA gør, effekten af ​​træk på hver enkelt skal være stort set den samme hver gang.

Med træk elimineret som en kilde til variation i translokationshastighed, forskerne forventede, at den eneste kilde til variation ville være effekten af ​​termisk bevægelse. De bittesmå virusmolekyler støder konstant op mod vandmolekylerne, hvori de er nedsænket. Et par tilfældige termiske spark bagfra ville fremskynde virussen, når den går gennem poren. Et par spark forfra ville bremse det.

Eksperimenterne viste, at mens termisk bevægelse forklarede meget af variationen i translokationshastighed, det forklarede ikke det hele. Til forskernes store overraskelse, de fandt en anden kilde til variation, der steg, når spændingen over poren blev forøget.

"Vi troede, at fysikken ville være krystalklar, " sagde Jay Tang, lektor i fysik og teknik ved Brown og en af ​​undersøgelsens medforfattere. "Du har denne stive [virus] med veldefineret diameter og størrelse, og du ville forvente et meget tydeligt signal. Som det viser sig, vi fandt noget forvirrende fysik, som vi kun delvist kan forklare os selv."

Forskerne kan ikke med sikkerhed sige, hvad der forårsager variationen, de observerede, men de har et par ideer.

"Det er blevet forudsagt, at afhængigt af hvor [et objekt] er inde i poren, det kan trækkes hårdere eller svagere, "Sagde McMullen." Hvis det er i midten af ​​poren, det trækker lidt svagere, end hvis det er lige på kanten. Det er blevet forudsagt, men aldrig eksperimentelt verificeret. Dette kunne være bevis på, at det sker, men vi arbejder stadig på opfølgning. "

Mod en nanopore sequencer og mere

En bedre forståelse af translokationshastighed kunne forbedre nøjagtigheden af ​​nanopore-sekventering, Siger McMullen. Det ville også være nyttigt i den afgørende opgave at måle længden af ​​DNA -tråde. "Hvis du kan forudsige translokationshastigheden, "Sagde McMullen, "så kan du nemt få længden af ​​DNA'et ud fra, hvor lang dets translokation var."

Forskningen hjalp også med at afsløre andre aspekter af translokationsprocessen, som kunne være nyttige i design af fremtidige enheder. Undersøgelsen viste, at den elektriske strøm har en tendens til at justere virushovedet først til poren, men i lejligheder, hvor de ikke står i kø, de har en tendens til at hoppe rundt på kanten af ​​poren, indtil termisk bevægelse tilpasser dem til at gå igennem. Imidlertid, når spændingen blev skruet for høj, de termiske virkninger blev undertrykt, og virussen satte sig fast på membranen. Det tyder på en sød plet i spænding, hvor hoved -først -translokation mest sandsynligt er.

Intet af dette kan observeres direkte - systemet er simpelthen for lille til at blive set i aktion. Men forskerne kunne udlede, hvad der skete, ved at se på små ændringer i strømmen på tværs af poren.

"Når vira savner, de rasler rundt og vi ser disse små bump i strømmen, " sagde Stein. "Så med disse små buler, vi begynder at få en idé om, hvad molekylet laver, før det glider igennem. Normalt er disse sensorer blinde for alt, hvad der foregår, indtil molekylet glider igennem."

Det ville have været umuligt at observere ved hjælp af DNA. Svagheden af ​​DNA-molekylet gør det muligt for det at gå gennem en pore i en foldet konfiguration, selvom det ikke er rettet direkte mod hinanden. Men fordi virussen er stiv, det kan ikke foldes for at gå igennem. Det gjorde det muligt for forskerne at isolere og observere disse kontaktdynamikker.

"Disse vira er unikke, " sagde Stein. "De er som perfekte små målestokke."

Ud over at kaste lys over grundlæggende fysik, værket kan også have en anden applikation. Selvom selve fd -virussen er harmløs, de bakterier, den inficerer - f. coli - er det ikke. På baggrund af dette arbejde, det kan være muligt at bygge en nanopore -enhed til at detektere tilstedeværelsen af ​​fd, og ved fuldmagt, e. coli. Andre farlige vira - Ebola og Marburg blandt dem - deler den samme stavlignende struktur som fd.

"Dette kan være en let måde at opdage disse vira på, "Sagde Tang." Så det er en anden potentiel anvendelse til dette. "