Demokratisering af enkeltmolekylær kraftanalyse med høj gennemstrømning

Fra spændingen ved sammentrækning af muskelfibre til hydrodynamiske belastninger i flydende blod, molekyler i vores kroppe er underlagt en lang række mekaniske kræfter, der direkte påvirker deres form og funktion. Ved at analysere enkeltmolekylers respons under forhold, hvor de oplever sådanne kræfter, kan vi udvikle en bedre forståelse af mange biologiske processer, og potentielt, udvikle mere nøjagtigt virkende lægemidler. Men indtil nu har eksperimentel analyse af enkeltmolekyleinteraktioner under kraft været dyr, kedeligt og svært at udføre, fordi det kræver brug af sofistikeret udstyr, såsom et atomkraftmikroskop eller optisk pincet, som kun tillader analyse af et molekyle ad gangen.

Nu, et forskerhold ledet af Wesley Wong ved Harvards Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering og Boston Children's Hospital har gjort et stort fremskridt ved at udvikle en billig metode, der tillader analyse af kraftresponserne på tusinder af lignende molekyler samtidigt. De melder ind Naturkommunikation hvordan programmerbare DNA -nanoswitches kan bruges i kombination med et nydesignet miniaturiseret Centrifuge Force Microscope (CFM) som et yderst pålideligt værktøj til at observere tusindvis af individuelle molekyler og deres reaktioner på mekaniske kræfter parallelt.

"Denne nye kombinerede tilgang vil give os og andre mulighed for at undersøge, hvordan enkeltmolekylekomplekser opfører sig, når de smides ud af deres ligevægt af den afstemmelige kraft, der genereres i vores nydesignede CFM. Ved at basere dette instrument på noget, som de fleste forskere allerede har og bruger - bordcentrifugen-vi håber at gøre enkeltmolekylære kraftmålinger tilgængelige for næsten alle, "sagde Wong, Ph.d., som er medlem af Wyss Institute Associate Faculty og undersøgelsens seniorforfatter. Han er også adjunkt ved Harvard Medical School i afdelingerne for biologisk kemi og molekylær farmakologi og pædiatri, og efterforsker i programmet i cellulær og molekylær medicin på Boston Children's Hospital.

Tidligere bestræbelser ledet af Wong ved Rowland Institute ved Harvard introducerede den første CFM i 2010, som var et højt specialiseret instrument, der udførte præcisionskraftmålinger med høj gennemstrømning på enkelte molekyler ved at binde dem til perler og trække i dem ved hjælp af centrifugalkraft. I sin seneste CFM -iteration, Wong og hans team udviklede en måde at udføre den samme teknik med lignende præcision ved hjælp af et lille billigt mikroskop fremstillet af let at samle elementer og 3D-printede dele, der kan indsættes i den svingende spand i en standard bænke-centrifuge, der findes i stort set alle biomedicinske forskningslaboratorier.

Ud over, teamet øgede analysens robusthed og nøjagtighed ved at integrere tusindvis af såkaldte DNA-nanoswitches, lineære DNA -tråde med par af interagerende molekyler, der er forbundet med to sekvenser i midten, og at, ud over, ved at binde til hinanden skabe en intern DNA -loop; nanoswitches ender er knyttet til overfladen af ​​prøven på den ene side og til perler på den anden.

"Ved at anvende et defineret område af centrifugalkræfter på perlerne kan vi fremprovokere brud på de molekylære komplekser, der genererer de loopede DNA-strukturer, som vil blive registreret af den kamerakoblede linse. Det er vigtigt, ved hjælp af DNA-nanoswitches som et stabilt stillads giver os mulighed for at gentage denne proces flere gange med det samme molekyle under temperaturkontrollerede forhold, hvilket i høj grad øger vores nøjagtighed ved bestemmelse af den heterogenitet, som en enkelt molekylær interaktion kan vise, "sagde Darren Yang, den første forfatter til undersøgelsen og en kandidatstuderende i Wongs team.

I fremtidig forskning, perle-associerede DNA-nanoswitches kan bruges til gentagne gange at samle og briste mange forskellige biomolekylære komplekser og til at definere de mekaniske kræfter, der styrer dem. "De integrerede DNA -nanoswitches er meget modulære, og kan funktionaliseres med mange forskellige biomolekyler på i det væsentlige plug-and-play måde, at gøre det muligt at studere en lang række molekylære interaktioner med høj gennemstrømning og pålidelighed, "tilføjede Wong.

Næste, Wyss-forskerne planlægger at anvende deres DNA-nanoswitch-forbedrede miniature CFM til undersøgelse af udvalgte biomedicinsk relevante og kraftafhængige molekylære interaktioner såsom proteininteraktioner, der styrer blodkoagulation eller hørelse.

"Wongs team har skabt en ny teknologiplatform, der i høj grad reducerer omkostningerne ved enkeltmolekylær kraftanalyse og gør den bredt tilgængelig for det videnskabelige samfund. Ud over at øge vores forståelse af grundlæggende molekylære struktur-funktionsrelationer, det kan vise sig at være et værdifuldt værktøj til udvikling af lægemidler, "sagde Wyss Institutes grundlægger, Donald Ingber, M.D., Ph.d., som også er Judah Folkman professor i vaskulær biologi ved Harvard Medical School og vaskulærbiologiprogrammet på Boston Children's Hospital, og professor i bioingeniør ved SEAS.