Med nanorør, genteknologi i planter er let-peasy

At indsætte eller tilpasse gener i planter er mere kunst end videnskab, men en ny teknik udviklet af University of California, Berkeley, videnskabsfolk kunne lave genteknologi enhver type plante - især genredigering med CRISPR-Cas9-enkelt og hurtigt.

For at levere et gen, forskerne podede det på et carbon nanorør, som er lille nok til let at glide gennem en plantes hårde cellevæg. Til dato, mest genteknologi af planter sker ved at affyre gener i vævet - en proces kendt som biolistik - eller levere gener via bakterier. Begge lykkes kun en lille procentdel af tiden, hvilket er en stor begrænsning for forskere, der søger at skabe sygdoms- eller tørkebestandige afgrøder eller at konstruere planter, så de lettere kan omdannes til biobrændstoffer.

Nanorør, imidlertid, har stor succes med at levere et gen til kernen og også til chloroplasten, en struktur i cellen, der er endnu sværere at målrette ved hjælp af nuværende metoder. Kloroplaster, som har deres egen adskilte, skønt lille, genom, absorbere lys og gemme dets energi til fremtidig brug, frigiver ilt i processen. En let genleveringsteknik ville være en velsignelse for forskere, der nu forsøger at forbedre effektiviteten af ​​lysenergiopsamling for at øge afgrødeudbyttet.

Nanorøret beskytter ikke kun DNA'et mod at blive nedbrudt af cellen, men forhindrer også, at den indsættes i plantens genom. Som resultat, teknikken tillader genmodifikationer eller sletninger, som i USA og andre lande end EU ikke ville udløse betegnelsen "genetisk modificeret, "eller GMO.

"En af fordelene er bare den tid, der spares med en teknologi som denne, "sagde Markita Landry, en UC Berkeley assisterende professor i kemisk og biomolekylær teknik. "Men jeg tror, ​​at de store fremskridt vil være evnen til hurtigt og effektivt at levere gener til planter på tværs af arter og på en måde, der kunne muliggøre dannelse af transgene plantelinjer uden integration af fremmed DNA i plantens genom."

En vigtig anvendelse ville være CRISPR-Cas9 genredigering:levering af genet til Cas9, som er enzymet, der målretter og skærer DNA, sammen med DNA -kodningsguiden RNA - Cas9s adresselabel - til at redigere specifikke gener med høj præcision. Og DNA bundet til et nanorør er meget hårdt.

"Vi vurderede konstruktionernes stabilitet og omkostninger og på begge punkter, dette er egnet til garage videnskab, "Sagde Landry." Du kan lægge disse ting i en kuvert og sende dem næsten hvor som helst. Du behøver ikke et køleskab, en genpistol, bakterie; du behøver ikke meget at arbejde med dem, og de er stabile i flere måneder. Vi kan generere dem i stor skala, fryse dem, optø dem - de er robuste små ting. "

Landry og hendes kolleger vil rapportere deres resultater online den 25. februar forud for offentliggørelse i tidsskriftet Naturnanoteknologi .

CRISPR levering

Landry opdagede, at nanorør let glider gennem plantecellevægge, som er kendt for deres hårde lag, mens du prøver at mærke celler med nanorørssensorer. Sensorerne endte inde i cellen, ikke på celleoverfladen.

Hun så straks, hvordan hun skulle vende dette rundt for at levere gener til planter. Nuværende metoder er besværlige og kan have lavt udbytte. Brug af genpistoler er ødelæggende; det er som at blæse et hul i en plantecelle og håbe, at dit gen og cellen begge overlever. Ikke alle planter kan blive inficeret med genbærende Agrobacterium, og en anden teknik, brug af patogene vira til at bære gener, fungerer for et endnu smallere udvalg af planter og risikerer at indsætte viralt DNA i plantens genom. Alle skal tilpasses til hver plante, og det leverede DNA er integreret i genomet:definitionen på GMO.

Glæder mig til at prøve det, Landry og hendes kolleger viklede genet for grønt fluorescerende protein (GFP) rundt om et nanorør og injicerede det i et organisk rucola -blad købt på et lokalt Whole Foods Market. Inden for en dag, plantecellerne glødede grønt under UV -lys, angiver, at GFP -genet var blevet transskriberet og oversat til protein, som om det var plantens eget gen.

Virkningen varede kun et par dage, imidlertid, sandsynligvis fordi proteinerne bliver genbrugt, og DNA nedbrydes langsomt.

En kort levetid er ikke en ulempe, imidlertid.

"En del af det, der gør platformen unik, er, at udtrykket er forbigående. Når vi ser i mikroskopet syv til ti dage senere, udtrykket er væk, fluorescensen er væk. Det er ikke tilfældet med Agrobacterium, "Sagde Landry. For forskere, der studerer, hvordan planter fungerer, at udtrykke et gen i en kort tid kan fortælle dem meget om genets rolle i cellen.

"For at dette skal være en meget nyttig platform, imidlertid, vi er nødt til at udtrykke et protein, der i sig selv har en permanent effekt på atomgenomet, "tilføjede hun.

Hendes plan er at pakke DNA ind i et enkeltstrenget plasmid, der derefter fastgøres til et carbon-nanorør. Inden for to eller tre dage efter diffusion i cellen, både Cas9 protein og CRISPR guide RNA ville blive udtrykt, tillader dem at koble sig sammen for at danne et ribonukleoproteinkompleks, der redigerer genomet, permanent. Hun har ikke fundet nogen toksiske virkninger fra nanorøret.

"Så, nu har du en plante, der er redigeret, men det ville blive betragtet som ikke-GMO uden for Europa, " hun sagde.

Opladning af nanorøret

Hun og hendes kolleger testede levering af nanorør i andre planter:tobak, en arbejdshest med plantegenetik; bomuld, hvis genom er notorisk svært at knække; og hvede. Genetisk konstruerede versioner af disse anlæg er allerede på markedet, men en forenklet teknik kunne fremskynde introduktionen af ​​nye og gavnlige gener. Tobak, for eksempel, er blevet konstrueret til at producere lægemidler, såsom kræftbehandling.

Selvom Landry og hendes kolleger endnu ikke helt forstår, hvordan levering af nanorør fungerer, let adgang til nanorør er ikke en total overraskelse, hun sagde. Plantens cellevægge lader tingene glide let ind, hvis de er mindre end omkring 5 til 20 nanometer, hvilket er meget mindre end 500 nanometer-størrelsesgrænsen for pattedyrsceller. Nanorørene er cirka 1 nanometer i diameter, selvom de er omkring 300 nanometer lange:plads nok til at vedhæfte snesevis af gener. Planteceller er i størrelsesordenen 10, 000 nanometer på tværs.

Hun og hendes laboratoriekolleger forsøgte forskellige teknikker til at vedhæfte DNA til nanorør og fandt ud af, at den strammeste binding fungerede bedst. Da forskerne gav nanorøret en positiv ladning, før de introducerede DNA'et, det sad som papir fast i en kam, der var ladet med statisk elektricitet.

Hun udfører nu eksperimenter med DNA origami -nanopartikler for bedre at forstå, hvad der sker inde i plantecellerne, efter at nanorøret og DNA kommer ind, og eksperimenterer med levering af nanorør til planter af andre typer molekyler, specifikt RNA og proteiner.

"Det fantastiske ved disse carbon nanorør er, at de er i stand til at komme forbi cellevæggen og gå ind i kernen eller ind i kloroplasterne. Det er et nyt fremskridt, der giver os mulighed for virkelig at få værktøjerne til genomredigering på plads, "sagde Brian Staskawicz, en professor i plante- og mikrobiel biologi og den videnskabelige direktør for landbrug ved Innovative Genomics Institute, som finansierer yderligere arbejde med CRISPR -levering af Landry og hendes team. "De næste trin ville være, kan vi levere ribonukleiske proteiner, eller kan vi levere mRNA eller DNA, der rent faktisk ville kode for CRISPR-Cas9? "