Direkte observation af intracellulær nanopartikeldannelse med nano-computertomografi

Det er i øjeblikket udfordrende direkte at observere dannelsen af ​​intracellulære nanostrukturer i laboratoriet. I en ny rapport, Miaomiao Zhang og et forskerhold i kemi, biovidenskab, medicinsk teknik og videnskab og teknologi, i Kina, brugte et rationelt designet lille molekyle forkortet NBC-Iod-CBT (forkortelse for 4-nitrobenzylcarbamat-Cys(SEt)-Asp-Asp-Phe(iod)-2-cyano-benzothiazol) og direkte observeret intracellulær nanopartikeldannelse med nanocomputertomografi ( nano-CT).

Under forsøgene, glutathion (GSH) reduktion og nitroreduktase (NTR) spaltningsmekanismer fik NBC-Iod-CBT-molekyler til at gennemgå en klik-kondensationsreaktion og selvsamle nanopartikler (NP'er) som Iod-CBT-NP'er. Da holdet udførte nano-CT-billeddannelse af NBC-Iod-CBT-behandlet, nitroreduktase-udtrykkende HeLa-celler i laboratoriet, de viste eksistensen af ​​selvsamlede Iod-CBT-NP'er i deres cytoplasma. Den nye strategi er nu offentliggjort den Videnskabens fremskridt og vil hjælpe livsforskere og bioingeniører med at forstå dannelsesmekanismerne for intracellulære nanostrukturer.

En smart strategi for nanomontering

Samling af nanostrukturer ved hjælp af små molekylære prækursorer inde i celler er en intelligent strategi med store fordele inden for molekylær billeddannelse og lægemiddellevering. Små molekyler kan nemt optages af celler, men de ryddes også hurtigt ud. I modsætning, nanostrukturer med terapeutiske midler har længere retentionstidsrammer i celler med højere styrke. Alligevel, det er meget sværere for en celle at optage en nanostruktur sammenlignet med et lille molekyle. Forskere aktiverer derfor nanostrukturer til cellulær optagelse ved at modificere celleoverfladen med målrettede sprænghoveder, ' men sådanne modifikationer kan sænke reproducerbarheden af ​​nanokomplekset. Som resultat, en nyligt udviklet smart metode har til formål at danne intracellulære nanopartikler, hvor cellekulturer inkuberet med en lille molekylær precursor vil have en nanostruktur i sig, til spændende anvendelser inden for molekylær billeddannelse og lægemiddellevering. Imidlertid, det er stadig svært at skelne mellem de kunstigt dannede nanostrukturer fra iboende cellulære strukturer. For at opnå dette, Zhang et al. først designet en jod (iod)-holdig lille molekyle precursor, de udsatte derefter forbindelsen for intracellulær enzym-instrueret selvsamling for at danne nanopartiklerne af interesse og brugte nano-CT (nanocomputertomografi) til at observere de intracellulære nanopartikler.

Den ioderede NBC-Iod-CBT lille molekylære struktur havde et rationelt design bestående af fire dele, som omfattede

1. Et 4-nitrobenxylcarbamat (NBC) substrat til nedbrydning af nitroreduktase (NTR),
2. Et latent cystein (Cys) motiv og 2-cyano-benzothiazol (CBT) strukturer til CBT-Cys klik kondensationsreaktioner,
3. Et ioderet område til kontrastforbedring af computertomografi, og
4. To hydrofile asparaginsyremotiver for god vandopløselighed under fysiologiske forhold

Når forbindelsen kom ind i nitroreduktase (NTR)-overudtrykkende hypoxiske (berøvet tilstrækkelige niveauer af ilt) cancerceller, de gennemgik selvsamling for at danne nanopartikler (NP'er), kendt som Iod-CBT-NP'er. For at inducere den nitroreduktase-(NTR)-udløste nanopartikeldannelse i laboratoriet, forskerne inkuberede det lille molekyle NBC-Iod-CBT med bufferede saltvandsopløsninger og tilsatte nitroreduktaseopløsningen i to timer for at danne nanostrukturer med synlige absorbanser mellem 500-700 nm.

Når Zhang et al. tilsat en nitroreduktasehæmmer kendt som dicoumarin til opløsningen, de synlige absorbanser af blandingerne faldt, bekræfter dannelsen af ​​nanostrukturer i nærvær af nitroreduktase. Ved hjælp af transmissionselektronmikroskopibilleder, holdet observerede udseendet af nanopartikler og brugte højtydende væskekromatografi (HPLC) og højopløsningsmatrixassisteret laserdesorptions-/ioniseringsmassespektrometri for at bekræfte dannelsen af ​​Iod-CBT-NP'er. Zhang et al. brugte derefter tredimensionelle (3-D) nano-CT-billeder af blandingen med en blød røntgenmikroskopi nano-CT for i sidste ende at rekonstruere 3-D nano-CT-billederne, hvor forskellige bestanddele af forbindelsen udviste forskellige røntgenabsorptionsevner. På denne måde eksperimentet gjorde det lettere for NBC-Iod-CBT-forbindelsen af ​​interesse at gennemgå NTR-udløst selvsamling for at danne de forventede nanopartikler (Iod-CBT-NP'er) i laboratoriet.

Intracellulær dannelse af Iod-CBT-NP'er og blød røntgenmikroskopi nano-CT billeddannelse

Zhang et al. Dernæst undersøgte den samme eksperimentelle proces til at inducere nanopartikel-selvsamling inde i celler. Forbindelsen af ​​interesse (NBC-Iod-CBT) havde højere selektivitet over for nitroreduktase, for derved at forhindre enhver mulig intracellulær interferens i nærværelse af andre intracellulære bestanddele såsom biothioler, oxidanter og aminosyrer. De humane cervikale HeLa-kræftceller overudtrykker typisk nitroreduktase (NTR) under hypoxiske forhold (berøvet tilstrækkelige niveauer af ilt), når de højeste eksperimentelle niveauer inden for otte timer. Når Zhang et al. inkuberede hypoxiske HeLa-celler med det lille molekyle NBC-Iod-CBT, de observerede den endelige dannelse af nanopartikler i de hypoxiske HeLa-celler. Ved hjælp af elektronmikroskopibilleder af cellerne, de viste eksistensen af ​​nanopartiklerne som forventet i cellecytoplasmaet.

For direkte at observere nanopartiklerne af interesse (Iod-CBT-NP) inde i cellerne, holdet eksperimentelt behandlede de hypoxiske HeLa-celler og afbildede dem ved hjælp af blød røntgenmikroskopi nano-CT. De brugte derefter hypoxiske HeLa-celler, der var forbehandlet med dicoumarin eller normoxia (normale niveauer af oxygen) som to positive kontroller og ubehandlede hypoxi- eller normoxia HeLa-celler som to negative kontroller. Resultaterne indikerede dannelsen af ​​Iod-CBT-nanopartiklerne i cytoplasmaet af hypoxiske HeLa-celler. Da de udsatte disse celler for behandling med nitroreduktasehæmmere, CT-kontrasten af ​​cytoplasmaet faldt. Holdet rekonstruerede 2-D-projektioner af cellerne for at opnå 3-D nanoCT-billeder. Ved at bruge den lineære absorptionskoefficient (LAC) eller den lineære dæmpningskoefficient, Zhang et al. bekræftede gennemførligheden af ​​intracellulær nanopartikeldannelse.

På denne måde Miaomiao Zhang og kolleger designede rationelt en iodiseret lille-molekyle NBC-Iod-CBT-konstruktion til direkte at danne og observere nanopartikler inde i celler ved hjælp af nano-CT. Efter førstehåndsforsøg udført in vitro, holdet gennemførte yderligere undersøgelser i cytoplasmaet af nitroreduktase-udtrykkende HeLa-celler. Ved hjælp af analytiske teknikker, holdet viste nanopartikel (Iod-CBT-NP) dannelse i det lille molekyle NBC-Iod-CBT-behandlede hypoxiske HeLa-celler. De verificerede deres metode ved hjælp af den lineære absorptionskoefficient og bekræftede gennemførligheden af ​​intracellulær nanopartikeldannelse. Dette arbejde vil hjælpe forskere med at få dybere indsigt i dannelsen af ​​intracellulære nanostrukturer med betydelige anvendelser inden for nanomedicin og bioteknik.

© 2020 Science X Network