Metoden tilbyder billig billeddannelse i skalaen af ​​viruspartikler

Ved hjælp af et almindeligt lysmikroskop, MIT-ingeniører har udtænkt en teknik til billeddannelse af biologiske prøver med nøjagtighed i skalaen på 10 nanometer - som skulle gøre dem i stand til at afbilde vira og potentielt endda enkelte biomolekyler, siger forskerne.

Den nye teknik bygger på ekspansionsmikroskopi, en tilgang, der involverer at indlejre biologiske prøver i en hydrogel og derefter udvide dem, før de afbildes med et mikroskop. For den seneste version af teknikken, forskerne udviklede en ny type hydrogel, der bevarer en mere ensartet konfiguration, giver mulighed for større nøjagtighed ved billeddannelse af små strukturer.

Denne grad af nøjagtighed kunne åbne døren til at studere de grundlæggende molekylære interaktioner, der gør livet muligt, siger Edward Boyden, Y. Eva Tan professor i neuroteknologi, en professor i biologisk ingeniørvidenskab og hjerne- og kognitionsvidenskab ved MIT, og medlem af MIT's McGovern Institute for Brain Research og Koch Institute for Integrative Cancer Research.

"Hvis du kunne se individuelle molekyler og identificere, hvilken slags de er, med encifret nanometer nøjagtighed, så kan du måske faktisk se på livets struktur. Og struktur, som et århundrede af moderne biologi har fortalt os, styrer funktion, siger Boyden, der er seniorforfatter til den nye undersøgelse.

Bladets hovedforfattere, som vises i dag i Natur nanoteknologi, er MIT-forsker Ruixuan Gao og Chih-Chieh "Jay" Yu Ph.D. '20. Andre forfattere omfatter Linyi Gao Ph.D. '20; tidligere MIT postdoc Kiryl Piatkevich; Rachael Neve, direktør for Gene Technology Core på Massachusetts General Hospital; James Munro, en lektor i mikrobiologi og fysiologiske systemer ved University of Massachusetts Medical School; og Srigokul Upadhyayula, en tidligere assisterende professor i pædiatri ved Harvard Medical School og en assisterende professor i residens for celle- og udviklingsbiologi ved University of California i Berkeley.

Lavpris, høj opløsning

Mange laboratorier rundt om i verden er begyndt at bruge ekspansionsmikroskopi, siden Boydens laboratorium først introducerede det i 2015. Med denne teknik, forskere forstørrer fysisk deres prøver omkring fire gange i lineær dimension, før de afbilder dem, giver dem mulighed for at generere billeder i høj opløsning uden dyrt udstyr. Boydens laboratorium har også udviklet metoder til mærkning af proteiner, RNA, og andre molekyler i en prøve, så de kan afbildes efter ekspansion.

"Hundredevis af grupper laver ekspansionsmikroskopi. Der er tydeligvis en ophobet efterspørgsel efter en nem, billig metode til nanobilleddannelse, " siger Boyden. "Nu er spørgsmålet, hvor gode kan vi blive? Kan vi komme ned til enkeltmolekylets nøjagtighed? For i sidste ende, du ønsker at nå en løsning, der når ned til livets grundlæggende byggesten."

Andre teknikker såsom elektronmikroskopi og superopløsningsbilleddannelse tilbyder høj opløsning, men det nødvendige udstyr er dyrt og ikke bredt tilgængeligt. Ekspansionsmikroskopi, imidlertid, muliggør billeddannelse i høj opløsning med et almindeligt lysmikroskop.

I et papir fra 2017, Boydens laboratorium demonstrerede opløsning på omkring 20 nanometer, ved hjælp af en proces, hvor prøver blev udvidet to gange før billeddannelse. Denne tilgang, såvel som de tidligere versioner af ekspansionsmikroskopi, er afhængig af en absorberende polymer fremstillet af natriumpolyacrylat, samles ved hjælp af en metode kaldet fri radikal syntese. Disse geler svulmer, når de udsættes for vand; imidlertid, en begrænsning ved disse geler er, at de ikke er fuldstændig ensartede i struktur eller tæthed. Denne uregelmæssighed fører til små forvrængninger i formen af ​​prøven, når den udvides, begrænser den nøjagtighed, der kan opnås.

For at overvinde dette, forskerne udviklede en ny gel kaldet tetra-gel, som danner en mere forudsigelig struktur. Ved at kombinere tetraedriske PEG-molekyler med tetraedriske natriumpolyacrylater, forskerne var i stand til at skabe en gitterlignende struktur, der er meget mere ensartet end de fri-radikalsyntetiserede natriumpolyacrylathydrogeler, de tidligere brugte.

Forskerne demonstrerede nøjagtigheden af ​​denne tilgang ved at bruge den til at udvide partikler af herpes simplex virus type 1 (HSV-1), som har en karakteristisk sfærisk form. Efter at have udvidet viruspartiklerne, forskerne sammenlignede formerne med figurerne opnået ved elektronmikroskopi og fandt ud af, at forvrængningen var lavere end den, der blev set med tidligere versioner af ekspansionsmikroskopi, giver dem mulighed for at opnå en nøjagtighed på omkring 10 nanometer.

"Vi kan se på, hvordan arrangementerne af disse proteiner ændrer sig, efterhånden som de udvides, og vurdere, hvor tæt de er på den sfæriske form. Det er sådan, vi validerede det og bestemte, hvor trofast vi kan bevare nanostrukturen af ​​formerne og de relative rumlige arrangementer af disse molekyler, " siger Ruixuan Gao.

Enkelte molekyler

Forskerne brugte også deres nye hydrogel til at udvide celler, herunder humane nyreceller og musehjerneceller. De arbejder nu på måder at forbedre nøjagtigheden til det punkt, hvor de kan afbilde individuelle molekyler i sådanne celler. En begrænsning af denne grad af nøjagtighed er størrelsen af ​​de antistoffer, der bruges til at mærke molekyler i cellen, som er omkring 10 til 20 nanometer lange. For at afbilde individuelle molekyler, forskerne ville sandsynligvis være nødt til at oprette mindre etiketter eller tilføje etiketterne, efter at udvidelsen var fuldført.

De undersøger også, om andre typer polymerer, eller modificerede versioner af tetragelpolymeren, kunne hjælpe dem med at opnå større nøjagtighed.

Hvis de kan opnå nøjagtighed ned til enkelte molekyler, mange nye grænser kunne udforskes, Boyden siger. For eksempel, videnskabsmænd kunne få et glimt af, hvordan forskellige molekyler interagerer med hinanden, som kunne kaste lys over cellesignalveje, aktivering af immunrespons, synaptisk kommunikation, lægemiddel-mål interaktioner, og mange andre biologiske fænomener.

"Vi ville elske at se på områder af en celle, som synapsen mellem to neuroner, eller andre molekyler involveret i celle-celle-signalering, og for at finde ud af, hvordan alle dele taler til hinanden, " siger han. "Hvordan arbejder de sammen, og hvordan går de galt i sygdomme?"