Hurtig oprensning og karakterisering af cirkulerende små ekstracellulære vesikler på en etiketfri lab-on-a-chip

Alle celler udskiller nanoskala ekstracellulære vesikler naturligt som lipid-dobbeltlags afgrænsede partikler. Derfor er de gyldige biomarkører til at identificere en række sygdomme.

Det er vigtigt effektivt at isolere små ekstracellulære vesikler og samtidig bevare udbyttet og renheden for at udforske deres potentiale i diagnostiske, prognostiske og terapeutiske anvendelser.

Konventionelle metoder til isolering har mangler, som omfatter lav renhed og udbytte, langvarige ekstraktionsprocedurer, specialiseret udstyr og høje omkostninger.

I en undersøgelse offentliggjort i Scientific Reports , Manju Sharma og et team af forskere i biomedicinsk ingeniørvidenskab ved University of Cincinnati Ohio U.S., udviklede en ny isolatorbaseret dielektroforetisk enhed til hurtigt at isolere små ekstracellulære vesikler fra biovæsker og cellekulturmedier baseret på deres dielektriske egenskaber.

Forskerne karakteriserede de små ekstracellulære vesikler isoleret fra biovæsker fra cancerpatienter ved hjælp af instrumentet og udførte en tredobbelt karakterisering med konventionel flowcytometri, avanceret billeddannende flowcytometri og mikroRNA-sekventering for at opnå et højt udbytte af rene ekstracellulære vesikler. Platformen er effektiv til hurtigt at isolere biomarkører og opretholde den biomolekylære integritet af vesiklerne.

Membranindkapslede biologiske kar

Biologisk set er små ekstracellulære vesikler membranindkapslede biologiske kar, der findes i biovæsker såsom blod, urin, spyt, sæd, modermælk og cerebrospinalvæske; frigivet af celler ind i det ekstracellulære rum.

Sådanne nanoskala vesikler kan horisontalt overføre deres biomolekylære last til at fungere som intercellulære signalvektorer. Sådanne ekstracellulære vesikler giver en høj grad af sensitivitet og specificitet på grund af deres fremragende stabilitet. Deres tidlige påvisning i flydende biopsier kan forbedre påvisningen af ​​kræftformer, infektioner og neurodegenerative og metaboliske sygdomme.

Isoleringen af ​​vesiklerne er imidlertid udfordrende på grund af deres nanoskalastørrelse og fysisk-kemiske egenskaber. Isoleringsmetoder afhænger typisk af egenskaberne af de ekstracellulære vesikler, og selvom sådanne enheder har lovende egenskaber, er deres produktionsomkostninger, prøvefortynding og tilbøjelighed til tilstopning iboende udfordringer.

Som svar udviklede Sharma og kolleger en klasse af ny isolatorbaseret dielektroforetisk tilgang med mikrosøjler i mikrofluidkanaler for hurtigt at opsluge nanopartikler baseret på deres størrelse og unikke dielektriske egenskaber.

Handlingsmekanisme

Enheden opretholdt en række mikropipetter, der er i stand til at isolere nanopartikler fra små prøvevolumener ved at påføre et betydeligt lavt elektrisk felt på tværs af pipetternes længde. Arkitekturen af ​​poregeometrien tillod isolering af ekstracellulære vesikler fra små prøvevolumener af konditionerede cellekulturmedier og biovæsker fra raske donorer.

I dette arbejde isolerede Sharma og teamet kræftpatienters biovæsker, som inkluderede serum, plasma og urin, efterfulgt af multiparametrisk karakterisering via flowcytometri og næste generations miRNA-sekventering.

• 

• 

Holdet rensede små ekstracellulære vesikler fra serum, plasma og urin i fosfatbufret saltvand ved at bruge den isolatorbaserede dielektroforetiske tilgang. Sharma og kolleger brugte transmissionselektronmikroskopi til at bekræfte tilstedeværelsen af ​​vesiklerne og udforskede multiparametrisk analyse af oprensede cirkulerende små ekstracellulære vesikler via flowcytometri.

Holdet isolerede vesiklerne og analyserede dem, efterfulgt af konventionelle flowcytometriundersøgelser. Forskerne viste yderligere kapaciteten og brugen af ​​enheden ved at karakterisere isolaterne gennem ImageStream-software.

Efter miRNA-sekventering kortlagde holdet 137 distinkte, modne miRNA-transkripter til det menneskelige genom på tværs af prøver for at inkludere enheden i miRNA-biomarkøranalysearbejdsgange. De udførte transkriptomiske profiler og udførte hovedkomponentanalyse.

Outlook

På denne måde viste Manju Sharma og kolleger kapaciteten og effektiviteten af ​​en lavspændings, etiketfri isolator-baseret dielektroforetisk enhed til at isolere små ekstracellulære vesikler fra serum, plasma og urin fra kræftpatienter gennem sub-mikron partikeldetektion, og multiparametrisk karakterisering ved brug af konventionel flowcytometri og avancerede flowcytometrimetoder.

Arbejdets RNA-koncentrationer var sammenlignelige med tidligere værker og bekræftede, at isoleringsmetoden var et levedygtigt alternativ til dem, der allerede var etableret i laboratoriet. De analytiske metoder kan være nyttige som flydende biopsiplatforme til at isolere små ekstracellulære vesikler og udvikle ekstracellulære vesikelbaserede diagnostiske og overvågningsplatforme.

Flere oplysninger: Manju Sharma et al., Hurtig oprensning og multiparametrisk karakterisering af cirkulerende små ekstracellulære vesikler ved hjælp af en etiketfri lab-on-a-chip enhed, Scientific Reports (2023). DOI:10.1038/s41598-023-45409-4

Journaloplysninger: Videnskabelige rapporter

© 2023 Science X Network