Hvad er Freeze Fracturing og hvorfor er det nyttigt i Cellbiology?

Cellemembraner består af phospholipider og vedhæftede eller indlejrede proteiner. Membranproteiner spiller vitale roller i cellens metabolisme og liv. Du kan ikke bruge almindelig mikroskopi til at visualisere eller karakterisere vedhæftningsproteiner, transportproteiner og proteinkanaler i cellemembranen. Ved anvendelse af elektronmikroskopi og en teknik kaldet "frysefraktur", der spalter frosne cellemembraner i hinanden, muliggør visualisering af membranstrukturen og tilrettelæggelsen af ​​proteiner i havet af phospholipider. Kombination af andre metoder med frysefraktur hjælper os ikke kun med at forstå strukturen af ​​forskellige cellemembraner og membranproteiner, men giver mulighed for visualisering og detaljeret analyse af funktionen af ​​specifikke proteiner, bakterier og vira.
Grundlæggende trin i frysefraktur

Ved anvendelse af flydende nitrogen fryses biologiske vævsprøver eller celler hurtigt for at immobilisere cellebestanddele. Cellemembraner er sammensat af to lag af fosfolipider, kaldet et dobbeltlag, hvor de hydrofobe eller vandhederende lipidstænger peger mod membranets indre, og de hydrofile eller vandbevidste ender af lipidmolekylet peger udad og mod indersiden af ​​cellen. Den frosne prøve er revnet eller brudt sammen med et mikrotom, hvilket er et knivlignende instrument til skæring af tynde vævsskiver. Dette medfører, at cellemembranen splittes nøjagtigt mellem de to lag, fordi tiltrækningen mellem de hydrofobe lipidhaler repræsenterer det svageste punkt. Efter frakturering gennemgår prøven en vakuumprocedure, kaldet "frysetætsning". Overfladen af ​​den brudte prøve er skygget med kulstof og platin damp for at danne en stabil replika, der følger konturerne i brudfladen. Syre bruges til at fordøje organisk materiale, der klæber til replikaen, hvilket efterlader en tynd platinaskal af den brudte membranoverflade. Denne skal analyseres derefter ved elektronmikroskopi.
Fryse ætsning

Fryse ætsning er vakuumtørringen af ​​en ufikset, frosset og frysefraktet biologisk prøve. Vakuumtørringsproceduren svarer til frysetørring af frugt og grøntsager, som pakkes og sælges i købmandsforretninger. Uden fryse-ætsning er mange detaljer af cellulær struktur dækket af iskrystaller. Dyb- eller fryse-ætsningstrinnet forbedrer og udvider den oprindelige frysefrakturmetode, hvilket muliggør observation af cellemembraner under forskellige aktiviteter. Det giver mulighed for analyse af ikke kun membranstrukturen, men også af intracellulære komponenter og giver detaljerede strukturelle oplysninger om bakterier, vira og store cellulære proteinkomplekser.
Sciencing Video Vault
Opret den (næsten) perfekte beslag: Her er Hvordan
Opret den (næsten) perfekte beslag: Her er hvordan elektronmikroskopi

Elektronmikroskopi kan afsløre og forstørre mere end en million gange de mindste organismer eller strukturer, såsom bakterier, vira, intracellulære komponenter og endda proteiner. Visualisering er skabt ved at bombardere en ultra-tynd prøve med en stråle af elektroner. De to elektronmikroskopimetoder er scanningselektronmikroskopi, eller SEM, og transmissionselektronmikroskopi eller TEM. Frysefrakturprøver analyseres rutinemæssigt med TEM. TEM har bedre opløsning end SEM og tilbyder strukturelle oplysninger ned til 3 nanometer af replikaer.
Revealing af cellemembranstruktur

Udviklingen og anvendelsen af ​​frysefrakturelektronmikroskopi viste, at celleplasmemembraner består af lipid-bilayere og præciseret, hvordan proteiner er organiseret i cellemembraner. Frysefraktur giver et unikt kig på det indre af cellemembraner, fordi det splitter og adskiller membranfosfolipider i to modsatte og komplementære ark eller ansigter. I mere end 50 år siden indførelsen af ​​den første frysebrudsmaskine er det stadig den eneste måde at opnå en strukturel information om cellemembranen på at lave en platin replika. Teknikken viser, om specifikke proteiner flyder eller forankres i cellemembranen, og om og hvordan nogle proteiner aggregerer. En nyere metode - ved hjælp af antistoffer, der målretter specifikke proteiner - kombineres med frysefraktur for at identificere proteiner og deres funktion i cellemembranen.