Videnskab
 science >> Videnskab >  >> Biologi

Sådan designes en PCR-primer

Ifølge University of Wisconsin's BioWeb-websted er en PCR-primer et kort syntetisk oligonukleotid (sædvanligvis mellem 18 og 25 baser langt) anvendt til at amplificere specifikke regioner af DNA i en molekylærbiologi teknik kendt som polymerasekædereaktion (PCR) . Både en fremadvendt og revers primer er nødvendig, der er designet til at være omvendte komplementer af DNA-strengen, at flanke og binde til det ønskede DNA-område. Når forskere ønsker at udføre forskning på et specifikt gen eller en region af DNA, skal de først udføre PCR for at erhverve nok af målområdet til at arbejde med. Design af primer-sekvenser for regionen af ​​interesse kan være nødvendig, hvis de ikke allerede er tilgængelige via tidligere offentliggjort forskning eller ved kommercielle midler.

Hent nukleotidsekvensen af ​​genet eller DNA-regionen af ​​interesse og afgøre, hvor længe et fragment du ønsker at forstærke. Frem- og bagsprimeren er designet til at binde i begyndelsen og i slutningen af ​​det ønskede fragment. Typisk bruger konventionelle PCR-metoder primere, der flanker en region mellem 100 og 1.000 basepar lange, mens realtids PCR-metoder bruger fragmenter på omkring 50 til 200 basepar lange.

Bestem, hvor i sekvensen du vil have primerne at lyve. Du kan f.eks. Ønske placeringen nær 5'- eller 3'-enden af ​​sekvensen eller i midten. Hvis det ønskes, skal du angive primers placering for at spænde over en intron.

Følg de anbefalede retningslinjer for primerdesign. Succesfuld amplifikation af DNA-produkt afhænger af primers kvalitet, og visse variabler er kritiske.

Design primere til 18 til 24 baser i længden. Vincent R. Prezioso, Ph.D., fra Brinkmann Instruments Inc., antyder, at denne længde er lang nok til at være yderst specifik for det ønskede DNA-område, men kort nok til at binde (anneal) let. Primer smeltetemperatur (Tm) bør være mellem 55 og 80 grader Celsius, lav nok til at tillade fuldstændig smeltning ved eller over 90 grader Celsius, men høj nok til at tillade glødning. GC-indholdet (procent af Gs og Cs i sekvensen) skal være mellem 40 og 60 procent. Primer-sekvensens 3'-ende skal ende i en C eller G (kaldet en GC-klemme) for at fremme binding, da G- og C-nucleotiderne har stærkere bindinger, undgår dog at have tre eller flere G'er eller C'er i de sidste fem baser af sekvensen.

Undgå at have kørsler på fire eller flere af en base (som ACCCC ...) eller fire eller flere di-nucleotid gentagelser (som ATATATAT ...), fordi de kan forårsage fejlprimning. Design primere uden intra-primer homologi (mere end tre baser, der supplerer inden for den ene primer i sig selv) eller inter-primer homologi (hvor den forreste og reverse primer har komplementære sekvenser). Dette kan forårsage selvdimere eller primerdimere, hvor primrene binder sig selv i stedet for at binde til den ønskede DNA-sekvens.

Brug online ressourcer og websteder, der hjælper med primerdesign eller hjælp til at kontrollere primer-sekvenser til selv- komplementaritet eller potentialet til at gøre sekundære strukturer som hårnåle. Nogle primerdesign websites omfatter Massachusetts Institute of Technology's Primer3, National Center for Biotechnology Information's Primer-Blast og Integrated DNA Technologies 'OligoAnalyzer.

Klik for at udvide hele teksten